寧夏枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白適宜提取方法研究

張琛，楊建軍，王晨，馬潔，楊涓，劉根紅，鄭蕊，鄭國琦

摘要：【目的】探索適合寧夏枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白提取方法，為后續(xù)進(jìn)行寧夏枸杞蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳詫幭蔫坭焦麑?shí)為試驗(yàn)材料，采用六步洗脫法去除胞漿蛋白，然后通過定量和電泳比較氯化鈣提取法、氯化鋰提取法、氯化鈣加氯化鋰結(jié)合提取法和苯酚提取法對(duì)細(xì)胞壁蛋白的提取效果，通過雙向電泳與液相色譜對(duì)所得細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】六步洗脫法可較好地除去胞漿蛋白與其他干擾物質(zhì)，4種方法對(duì)寧夏枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白的提取效果排序?yàn)椋郝然}提取法（272 μg/g）>苯酚提取法（261 μg/g）>氯化鈣加氯化鋰結(jié)合提取法（217 μg/g）>氯化鋰提取法（176 μg/g）。裂解液I[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、30 g/L 3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、50 g/L 二硫蘇糖醇（DTT）]溶解蛋白質(zhì)效果更優(yōu)，蛋白質(zhì)定量濃度更高、電泳條帶更多、更清晰。氯化鈣提取所得蛋白質(zhì)樣品雙向電泳結(jié)果較好，蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)較多、清晰度和分辨率較高;通過液相色譜可看出氯化鈣提取的細(xì)胞壁蛋白肽段種類多，且大部分相對(duì)豐度較高，并含有低豐度蛋白質(zhì)。所測(cè)蛋白質(zhì)分類中有細(xì)胞壁定位的蛋白質(zhì)?！窘Y(jié)論】氯化鈣單獨(dú)提取蛋白質(zhì)樣品的方法是寧夏枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白提取最優(yōu)方法，所得蛋白質(zhì)樣品已達(dá)到進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞： 寧夏枸杞;細(xì)胞壁蛋白;提取方法

中圖分類號(hào)： S567.19? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）09-2534-09

Optimization of extraction method of the cell wall protein of Lycium barbarum L.

ZHANG Chen1， YANG Jian-jun2， WANG Chen1， MA Jie1， YANG Juan1，

LIU Gen-hong1， ZHENG Rui1， ZHENG Guo-qi1*

（1College of Life Science， Ningxia University， Yinchuan? 750021， China; 2Ningxia Rural Economic

Management Station， Yinchuan? 750002， China）

Abstract：【Objective】To explore the suitable extraction scheme of cell wall protein from Lycium barbarum L. fruit，which provided technical support for the subsequent proteomic research of L. barbarum L. 【Method】Using L. barbarum L. fruit as experimental material and six-step elution method was used to remove cytoplasm proteins，then comparing cell wall protein extraction effect with calcium chloride extraction method，lithium chloride extraction method，calcium chloride plus lithium chloride extraction method and phenol extraction method by protein quantitation and electrophoresis. Cell wall proteins were examined by two dimensional electrophoresis（2-DE） and liquid chromatography（LC）. 【Result】Cytoplasmic protein and other interfering substances could be removed better using the six-step elution method. The extraction effect of the four methods on cell wall protein of L. barbarum L. fruit was ranked as follows： calcium chloride extraction method（272 μg/g）>phenol extraction method（261 μg/g）>calcium chloride plus lithium chloride extraction me-thod（217 μg/g）>lithium chloride extraction method（176 μg/g）. The dissolution effect of lysis buffer I[7 mol/L urea，2 mol/L thiourea，30 g/L 3-[3-（cholamidopropyl） dimethylamino]-1-propanesulfonate （CHAPS），50 g/L dithiothreitol（DTT）] was better，the quantitative concentration of protein was higher，and the electrophoretic bands were more and clearer. The results of two-dimensional electrophoresis of the protein samples extracted by calcium chloride were better，with more protein spots，higher clarity and resolution，and the liquid chromatography showed that there were many kinds of cell wall protein peptides extracted by calcium chloride method，and most of them had high relative abundance，and contained low abundance proteins. In the classification of the tested proteins，some proteins located on the cell wall. 【Conclusion】The method of extracting protein sample by calcium chloride alone is the best method to extract cell wall proteins from Ningxia L. barbarum L. fruit，and the obtained protein sample has reached the standard of proteomics research.

Key words： Lycium barbarum L.; cell wall proteins; extraction method

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（81760682，31660363）;Ningxia Natural Science Foundation （2020AAC03097）;Ningxia Lycium barbarum Industry Development Center Project（2020）

0 引言

【研究意義】寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）為茄科枸杞屬植物，是我國重要的藥用植物資源（國家藥典委員會(huì)，2015）。其果實(shí)干燥后為馳名中外的名貴中藥材枸杞子，枸杞子的藥理作用使其一直受到中外醫(yī)學(xué)與食療專家的高度重視，而枸杞多糖被公認(rèn)是枸杞子中最重要的藥用成分。枸杞多糖是一種細(xì)胞壁多糖，提純后以-O-連接的糖蛋白，屬于type Ⅱ類型的阿拉伯半乳聚糖蛋白（Arabinogalactan proteins，AGPs）之一（田庚元，2003;Redgwell et al.，2011）。AGP是植物細(xì)胞壁蛋白中富含羥脯氨酸的糖蛋白（HRGP）超家族中高度糖基化的成員，可能與果實(shí)成熟期間細(xì)胞擴(kuò)張有關(guān)（Leszczuk et al.，2019）。已有研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖在果實(shí)轉(zhuǎn)色期和成熟期（果實(shí)膨大階段）大量增加（Zheng et al.，2010;Bao et al.，2016）。枸杞多糖的積累具有一定的時(shí)空特異性，與其積累相關(guān)的蛋白質(zhì)或酶必然也呈動(dòng)態(tài)變化。為確定與枸杞多糖積累相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)或酶，需開展枸杞果實(shí)細(xì)胞壁差異化蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究。細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可促進(jìn)枸杞多糖積累生理生化機(jī)制的研究（Kambiranda et al.，2016）。細(xì)胞壁蛋白（Cell wall proteins，CWPs）分離是細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要部分，而植物細(xì)胞壁蛋白質(zhì)因其特殊的定位和在提取時(shí)易受到胞漿蛋白污染的特性，使得其提取和分離較其他細(xì)胞器分布的蛋白質(zhì)更加困難（Lee et al.，2004）。因此，研究寧夏枸杞細(xì)胞壁蛋白適宜提取方法，對(duì)使用細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究枸杞多糖積累的生理生化機(jī)制有重要意義，同時(shí)對(duì)進(jìn)一步調(diào)控枸杞品質(zhì)具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物細(xì)胞壁在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，參與植物細(xì)胞的生長、分化、抗逆和細(xì)胞間的相互識(shí)別等許多重要的生命活動(dòng)（Jamet et al.，2010;劉艷麗等，2018）。植物細(xì)胞壁是一個(gè)復(fù)合結(jié)構(gòu)，在構(gòu)成細(xì)胞壁的成分中，約90%是多糖，約10%是蛋白質(zhì)、酶類及脂肪酸，其中細(xì)胞壁蛋白是細(xì)胞壁生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)形成、細(xì)胞壁成分修飾、細(xì)胞生長和信號(hào)傳導(dǎo)以及與質(zhì)膜蛋白的相互作用等過程密不可分（Wang and Komatsu，2016;劉艷麗等，2018）。近年來，各種組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究發(fā)育成熟過程中果實(shí)品質(zhì)變化的機(jī)理提供了強(qiáng)有力的手段，而細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)已成為一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。植物細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)研究始于2000年，現(xiàn)已在苜宿（Watson et al.，2004;Verdonk et al.，2012;Printz et al.，2015）、黃瓜（孟祥南等，2015）、楊樹（陳穎等，2015）、小麥、擬南芥（Canut et al.，2017;Duruflé et al.，2017）、大豆、番茄等多種植物上進(jìn)行研究，且這些植物在細(xì)胞壁蛋白提取和分離鑒定上也取得了明顯突破（Jamet et al.，2010;劉艷麗等，2018）。由于提取時(shí)單一提取劑有時(shí)難以獲得高質(zhì)量細(xì)胞壁蛋白，因此也常用二步法或三步法進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白提取，如Canut等（2017）、Duruflé等（2017）使用二步法（氯化鈣和氯化鋰）提取擬南芥各組織細(xì)胞壁蛋白。提取苜蓿莖細(xì)胞壁蛋白時(shí)，三步法（氯化鈣、EGTA和氯化鋰）（Printz et al.，2015）效果優(yōu)于二步法（EGTA和氯化鋰）（Verdonk et al.，2012）。陳穎等（2015）分別使用氯化鋰和氯化鈣提取楊樹葉片細(xì)胞壁蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯化鈣所提蛋白質(zhì)電泳條帶更清晰，濃度也高于氯化鋰所提蛋白?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不少學(xué)者對(duì)枸杞進(jìn)行了研究（田庚元，2003;鄭蕊，2012;馬麗娟等，2020;張?chǎng)蔚龋?020），但關(guān)于枸杞細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)研究卻未見報(bào)道。不同細(xì)胞壁蛋白質(zhì)材料的獲取也已有不少研究（Watson et al.，2004;Verdonk et al.，2012;Printz et al.，2015;Canut et al.，2017;Duruflé et al.，2017），但能否應(yīng)用于枸杞尚不確定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以寧夏枸杞果實(shí)為材料，使用六步洗脫法分離出細(xì)胞壁組分，采用不同提取法對(duì)枸杞細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行提取，通過定量和電泳結(jié)果比較選出最優(yōu)提取方法，并對(duì)比分析不同裂解液對(duì)定量和電泳結(jié)果的影響，同時(shí)通過雙向電泳與液相色譜對(duì)所得細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，以期篩選出一種適宜提取寧夏枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白的方法，為寧夏枸杞細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

寧夏枸杞果實(shí)由寧夏育新枸杞種業(yè)有限公司提供。選取6年生寧杞1號(hào)植株，在盛花期標(biāo)記5000朵，分別選取花后8、24和34 d的枸杞果實(shí)進(jìn)行采摘，所采果實(shí)即為青果、轉(zhuǎn)色果和紅果，液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ饕噭号Ｑ宓鞍祝↙R，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;考馬斯亮藍(lán)G-250（LR，Biotopped）;無水氯化鈣、無水氯化鋰、無水乙酸鈉、氯化鈉、尿素、硫脲（AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠）;丙酮（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;苯酚（重蒸試劑，北京索萊寶科技有限公司）;二硫蘇糖醇（DTT）、3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）（AR，Bio-Rad）。主要儀器設(shè)備：高速冷凍離心機(jī)（Thermo）;恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）;HYQ-2121A混勻器（美國精騏有限公司）;電泳儀（GE Healthcare EPS601）;Easy nLC色譜系統(tǒng)（Thermo Scientific）;DYCZ-24EN電泳儀（北京六一生物科技有限公司）;DYY-6C型電泳儀電源（北京六一儀器廠）。

1. 2 細(xì)胞壁物質(zhì)提取與胞漿蛋白去除

細(xì)胞壁組分提取參照Watson等（2004）的方法進(jìn)行。從-80 ℃冰箱中取10 g枸杞果實(shí)（青果、轉(zhuǎn)色果和紅果），放入-20 ℃冰箱中回軟，取出后迅速去中軸胎座，放入培養(yǎng)皿中稱量，液氮研磨。將研磨好的組織轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，用勻漿緩沖液（50 mmol/L乙酸鈉、50 mmol/L氯化鈉和30 mmol/L抗壞血酸）沖洗研缽和研杵，共30 mL，振蕩20 min，13000×g離心20 min;在離心后的沉淀中再加入30 mL勻漿緩沖液，振蕩20 min，13000×g離心20 min;將2次離心所得上清液合并后混勻?yàn)閃1。之后依次對(duì)沉淀進(jìn)行5次洗脫，每次使用洗脫液60 mL[5次洗脫液分別為：①洗脫緩沖液1（100 mmol/L氯化鈉）、②雙蒸水、③丙酮（80%，v/v）、④丙酮（80%，v/v）、⑤洗脫緩沖液2（10 mmol/L氯化鈉）];每次洗脫將對(duì)應(yīng)洗脫液分為兩部分先后加入沉淀，振蕩20 min，13000×g離心20 min，將2次離心所得上清液合并后混勻，分別為W2、W3、W4、W5和W6。最終6次洗脫所得上清液為胞漿蛋白，沉淀凍干后即為細(xì)胞壁組分。每種果實(shí)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1. 3 胞漿蛋白提取與純化

分別給紅果六步洗脫中每步所得上清液（胞漿蛋白）加入15%三氯乙酸，沉淀2 h，13000×g離心20 min，棄除上清液，將沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，13000×g離心20 min，棄除上清液，用丙酮清洗沉淀3次，每次清洗后13000×g離心20 min。所得沉淀即為胞漿蛋白。

1. 4 裂解液選擇與蛋白質(zhì)含量測(cè)定

取六步胞漿蛋白樣品（紅果），分別加入100 μL裂解液I（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、30 g/L CHAPS、50 g/L DTT）和裂解液II（9 mol/L尿素、30 g/L CHAPS、50 g/L DTT）進(jìn)行裂解，用光滑的玻璃棒搗碎，27 ℃水浴30 min，渦旋幾秒鐘，重復(fù)多次，直到蛋白質(zhì)裂解充分。于常溫下1000×g離心30 s，上清液用于定量和電泳。分別在每管中取20 μL進(jìn)行定量，蛋白質(zhì)定量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法（高俊鳳，2006）進(jìn)行，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。最終通過定量結(jié)果和電泳結(jié)果進(jìn)行裂解液的篩選。

1. 5 細(xì)胞壁蛋白提取

分別用4種方法制備細(xì)胞壁蛋白樣品，通過定量和電泳結(jié)果比較選出適用于寧夏枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白提取的最優(yōu)方法。

1. 5. 1 氯化鈣加氯化鋰結(jié)合提取法 將六步洗脫后的沉淀（青果、轉(zhuǎn)色果和紅果）置于50 mL離心管內(nèi)，加入7.5 mL提取緩沖液1（氯化鈣緩沖液），將離心管放入低溫盒中，傾斜管子，固定在搖床輕搖1 h，13000×g離心30 min，收集上清液至錐形瓶中;然后在沉淀中加入7.5 mL提取緩沖液2（氯化鋰溶液），將離心管放入低溫盒中，傾斜管子，固定在搖床輕搖1 h，13000×g離心30 min，收集上清液至錐形瓶中。將提取緩沖液1和提取緩沖液2提取的上清液合并，加入2倍體積的80%丙酮，孵育30 min，13000×g離心20 min，收集沉淀，將上清液漂洗3次，每次漂洗后離心，并收集沉淀在相同標(biāo)號(hào)的EP管中，于4 ℃下13000×g離心5 min。凍干處理所得沉淀即為蛋白質(zhì)樣品。

1. 5. 2 氯化鈣提取法 將六步洗脫后的沉淀（青果、轉(zhuǎn)色果和紅果）置于50 mL離心管內(nèi)，加入7.5 mL提取緩沖液1（氯化鈣緩沖液），將離心管放入低溫盒中，傾斜管子，固定在搖床輕搖1 h，13000×g離心30 min，收集上清液至錐形瓶中，重復(fù)此步驟。將2次提取的上清液合并，加入2倍體積的80%丙酮，孵育30 min，13000×g離心20 min，收集沉淀，將上清液漂洗3次，每次漂洗后離心并收集沉淀在相同標(biāo)號(hào)的EP管中，于4 ℃下13000×g離心5 min。凍干處理所得沉淀即為蛋白質(zhì)樣品。

1. 5. 3 氯化鋰提取法 將六步洗脫后的沉淀（青果、轉(zhuǎn)色果和紅果）置于50 mL離心管內(nèi)，加入7.5 mL提取緩沖液2（氯化鋰緩沖液），將離心管放入低溫盒中，傾斜管子，固定在搖床輕搖1 h，13000×g離心30 min，收集上清液至錐形瓶中，重復(fù)此步驟。將2次提取的上清液合并，加入2倍體積的80%丙酮，孵育30 min，13000×g離心20 min，收集沉淀，將上清液漂洗3次，每次漂洗后離心，并收集沉淀在相同標(biāo)號(hào)的EP管中，于4 ℃下13000×g離心5 min。凍干處理所得沉淀即為蛋白質(zhì)樣品。

1. 5. 4 苯酚提取法 苯酚提取法參照H.蒂勒門特等（2013）的方法進(jìn)行。將六步洗脫后的沉淀（青果、轉(zhuǎn)色果和紅果）用15 mL提取緩沖液重新懸浮，懸浮液與同體積冰冷的Tris-緩沖苯酚（pH=8）混合，在4 ℃下振蕩30 min，4 ℃下孵育2 h，并在4 ℃下13000×g離心20 min。樣品從上到下分為有機(jī)相、水相和沉淀相，小心地將上層苯酚轉(zhuǎn)移至新的離心管中（注意避免碰觸中間層），而底部的水相用等體積苯酚反萃取。向苯酚相中加入5倍體積含0.1 mol/L乙酸氨的冷甲醇溶液，使蛋白質(zhì)沉淀。顛倒振蕩離心管，在-20 ℃下沉淀至少4 h，或過夜。離心沉淀蛋白質(zhì)（13000×g、30 min、4 ℃），回收沉淀蛋白質(zhì)，再用含0.1 mol/L乙酸銨的冷甲醇溶液漂洗回收沉淀3次，最后用預(yù)冷的80%（v/v）2倍體積的丙酮漂洗3次。在每次漂洗后，樣品均需離心（13000×g、5 min、4 ℃）。凍干處理所得沉淀即為蛋白質(zhì)樣品。

將以上4種提取法所得蛋白質(zhì)樣品加入100 μL蛋白質(zhì)裂解液I，充分裂解后取上清液20 μL進(jìn)行定量和25 μL上樣電泳。

1. 6 SDS-PAGE電泳

1. 6. 1 1-D電泳 胞漿蛋白電泳：取青果、轉(zhuǎn)色果和紅果六步洗脫液裂解后的前2步上清液10 μL、后4步25 μL點(diǎn)樣（W1：39 μg，W2：3.5 μg，W3：6.2 μg，W4：4.0 μg，W5：2.8 μg，W6：2.8 μg），進(jìn)行1-D電泳分析。凝膠電泳分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，初始電壓110 V，至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)分離膠后改為210 V恒壓，電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部1 cm時(shí)終止電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。

不同方法提取的細(xì)胞壁蛋白電泳：取不同方法提取的細(xì)胞壁蛋白樣品裂解后25 μL上清液點(diǎn)樣（氯化鈣加氯化鋰結(jié)合提取法：271 μg，氯化鈣提取法：340 μg，氯化鋰提取法：220.5 μg，苯酚提取法：327 μg），進(jìn)行1-D電泳分析。

氯化鈣提取不同時(shí)期果實(shí)細(xì)胞壁蛋白電泳：取氯化鈣提取的3種果實(shí)（青果、轉(zhuǎn)色果和紅果）細(xì)胞壁蛋白樣品裂解后20 μL上樣，進(jìn)行1-D電泳分析。

1. 6. 2 2-D電泳 2-D電泳參照鄭蕊（2012）的方法，并有所改變。取氯化鈣提取法提得青果（A3）蛋白質(zhì)樣品150 ?g，加入100 ?L上樣緩沖液（10% SDS、0.5%溴酚藍(lán)、50%甘油、500 mmol/L DTT、250 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8），沸水浴5 min，進(jìn)行12.5% SDS-PAGE電泳（恒流14 mA，90 min），考馬斯亮藍(lán)染色。

1. 7 液相色譜檢測(cè)

取氯化鈣提取法提得青果（A3）蛋白質(zhì)裂解后溶液30 ?L，采用Wi?niewski等（2009）的方法進(jìn)行酶切。高效液相色譜將樣品采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)EasynLC進(jìn)行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱以95%的A液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到上樣柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap100，100 μm×2 cm，nano Viper C18），經(jīng)分析柱（Thermo Scientific EASY Column，10 cm，ID 75 μm，3 μm，C18-A2）分離，流速300 nL/min。使用Proteome Discoverer-MASCOT分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，查詢數(shù)據(jù)庫為Uniprot Solanoideae數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2. 1 裂解液的比較與細(xì)胞壁組分的確定

紅果的六步洗脫所提取的胞漿蛋白加入裂解液I后定量和電泳結(jié)果如圖1和圖2所示，加入裂解液II后定量和電泳結(jié)果如圖3和圖4所示。加入裂解液I后，后5步洗脫液胞漿蛋白濃度顯著低于第1步洗脫液胞漿蛋白（P<0.05，下同）（圖1）;加入裂解液II后，后5步洗脫液胞漿蛋白濃度顯著低于第1步洗脫液胞漿蛋白濃度，后4步洗脫液胞漿蛋白濃度顯著低于第2步洗脫液胞漿蛋白濃度（圖3）。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)使用裂解液I后所測(cè)得蛋白質(zhì)濃度明顯高于加入裂解液II。如圖2所示，加入裂解液I后，前3步還可看到清晰的蛋白質(zhì)條帶，后5步洗脫液電泳圖已無明顯背景;而加入裂解液II后，電泳圖無明顯背景與清晰蛋白質(zhì)條帶（圖4）。結(jié)果表明裂解液I效果優(yōu)于裂解液II，到最后一步胞漿蛋白已經(jīng)幾乎洗脫完全。

2. 2 寧夏枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白提取方法的比較結(jié)果

由圖5可知，4種提取方法所得枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白樣品中蛋白質(zhì)含量排序?yàn)椋郝然}提取法（272 μg/g）>苯酚提取法（261 μg/g）>氯化鈣加氯化鋰結(jié)合提取法（217 μg/g）>氯化鋰提取法（176 μg/g），其中氯化鈣提取法和苯酚提取法所得蛋白質(zhì)含量顯著高于氯化鈣加氯化鋰結(jié)合提取法和氯化鋰提取法，且氯化鈣提取法試驗(yàn)結(jié)果平行性最好。電泳結(jié)果（圖6）與圖5結(jié)果相吻合，電泳結(jié)果表明相同條件下氯化鈣提取的蛋白質(zhì)較苯酚提取法所得蛋白質(zhì)的雜質(zhì)少（背景顏色淺）、質(zhì)量高（條帶更清晰）;氯化鈣提取法所得蛋白質(zhì)與氯化鈣加氯化鋰結(jié)合提取法所得蛋白質(zhì)電泳條帶基本吻合，氯化鋰提取法所得蛋白質(zhì)電泳條帶可在其電泳條帶中找到對(duì)應(yīng)條帶，說明氯化鈣提取法所得蛋白質(zhì)基本可覆蓋氯化鈣加氯化鋰結(jié)合提取法所提蛋白質(zhì)。

2. 3 氯化鈣提取法提取的寧夏枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白質(zhì)

將青果、轉(zhuǎn)色果和紅果各取3份，用氯化鈣提取法提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量和電泳，結(jié)果（表1和圖7）表明，各組蛋白質(zhì)樣品制備正常，氯化鈣提取法對(duì)3個(gè)時(shí)期枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白質(zhì)提取均有效。由表1可知，不同時(shí)期果實(shí)組內(nèi)結(jié)果平行性較好，組間定量結(jié)果有明顯差異。由圖7可知，不同時(shí)期果實(shí)所提蛋白質(zhì)電泳結(jié)果背景顏色淺、電泳條帶清晰，組內(nèi)圖譜相似，均能滿足蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量要求。

2. 4 2-DE和液相色譜結(jié)果驗(yàn)證

為驗(yàn)證氯化鈣提取法所提蛋白質(zhì)能否進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)，進(jìn)一步確定枸杞細(xì)胞壁蛋白樣品中蛋白質(zhì)情況，選取A3樣品進(jìn)行雙向電泳試驗(yàn)和色譜分析（由各蛋白質(zhì)樣品的定量和電泳結(jié)果來看3個(gè)時(shí)期9個(gè)樣品平行性均較好，故隨機(jī)選擇A3進(jìn)行驗(yàn)證）。雙向電泳試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，得到斑點(diǎn)大小、形狀、位置與肉眼觀察較為接近的圖譜;圖譜無明顯橫紋，蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)較多，大部分蛋白質(zhì)點(diǎn)無拖尾現(xiàn)象，清晰度和分辨率較高，雙向電泳試驗(yàn)結(jié)果較好。液相色譜分析后得到Basepeak圖譜，Basepeak圖是在液相色譜過程中將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)最強(qiáng)的肽段強(qiáng)度值連續(xù)描繪得到的圖譜。如圖9所示，橫坐標(biāo)為肽段在色譜中的保留時(shí)間，縱坐標(biāo)為質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，主要峰上的數(shù)字標(biāo)記分別為信號(hào)峰強(qiáng)度最高的肽段的保留時(shí)間和質(zhì)荷比。從色譜圖上看到在不同時(shí)間洗脫的峰較多（肽段種類多），且相對(duì)豐度較高，有部分信號(hào)峰強(qiáng)度弱（含有低豐度蛋白質(zhì)）。經(jīng)Proteome Discoverer-MASCOT軟件分析在Uniprot Solanoideae數(shù)據(jù)庫共查到蛋白質(zhì)241個(gè)，其中獨(dú)有肽段≥2的有93個(gè)。此外，除去未知蛋白，將剩余141個(gè)蛋白質(zhì)初步分成14類（表2），可看出所提蛋白質(zhì)中有細(xì)胞壁定位的蛋白質(zhì)（8種）。

3 討論

本研究中，使用裂解液I裂解蛋白質(zhì)定量后濃度大于裂解液II，且裂解后蛋白質(zhì)電泳條帶清晰，而經(jīng)裂解液II裂解的蛋白質(zhì)幾乎沒有條帶，說明裂解液I對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度更大。裂解液I相對(duì)于裂解液II增添了硫脲，硫脲可增加堿性蛋白質(zhì)的溶解度，與鄭蕊（2012）研究發(fā)現(xiàn)加入硫脲的裂解液裂解蛋白質(zhì)后定量與電泳效果較好的結(jié)果一致。加入裂解液I后，胞漿蛋白電泳圖W6幾乎沒有條帶，與Watson等（2004）研究得到紫花苜蓿莖細(xì)胞壁蛋白質(zhì)提取中胞漿蛋白質(zhì)的電泳圖基本一致，到第六步幾乎沒有蛋白質(zhì)的條帶，認(rèn)為六步洗脫液洗脫去胞漿蛋白，提取后最終所得的沉淀即為細(xì)胞壁組分。

根據(jù)細(xì)胞壁蛋白與細(xì)胞壁其他成分的結(jié)合程度，可將其分為3類：疏松結(jié)合型蛋白質(zhì)、松散結(jié)合離子型蛋白質(zhì)和緊密結(jié)合交聯(lián)型蛋白質(zhì)。結(jié)合程度的差異也是導(dǎo)致細(xì)胞壁蛋白提取困難的原因之一，因此提取劑的選擇十分重要（劉艷麗等，2018）。目前，多采用鹽溶液萃取法提取細(xì)胞壁蛋白，常用的鹽溶液有氯化鈉、氯化鈣和氯化鋰等，其中，氯化鈣是提取高等植物細(xì)胞壁蛋白的最有效試劑（Jamet et al.，2010），氯化鋰常用于提取強(qiáng)離子結(jié)合型蛋白質(zhì)（劉艷麗等，2018）。苯酚提取法為常用的傳統(tǒng)植物蛋白質(zhì)提取方法，可有效去除酚類化合物、色素和多糖等（裘劼人等，2020）。而本研究發(fā)現(xiàn)使用苯酚提取法所提細(xì)胞壁蛋白雜質(zhì)多于其他3種方法，可能是因?yàn)楸椒犹崛》▽?duì)疏水性蛋白質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等其他細(xì)胞器蛋白質(zhì)的提取造成（裘劼人等，2020）。氯化鈣提取法提取寧夏枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白所得蛋白質(zhì)含量最多，從電泳效果來看無明顯雜質(zhì)干擾，基本可覆蓋氯化鋰提取法所提蛋白質(zhì)，與孟祥南等（2015）在進(jìn)行黃瓜葉片細(xì)胞壁蛋白提取時(shí)發(fā)現(xiàn)鹽提法較酚提法效率更高，污染率更低的研究結(jié)果一致。陳穎等（2015）同樣發(fā)現(xiàn)在提取楊樹胞外蛋白時(shí)氯化鈣提取法優(yōu)于氯化鋰提取法。

雖然蛋白質(zhì)分離技術(shù)不斷更新，但雙向電泳技術(shù)仍是重要的蛋白質(zhì)分離手段（張麗等，2011）。雙向電泳是唯一能同時(shí)將上千種蛋白質(zhì)分離和展示的方法，在蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)揮著重要作用（Li et al.，2017）。蛋白質(zhì)提取是電泳成敗的關(guān)鍵，目前用于電泳的蛋白質(zhì)提取方法主要為蛋白質(zhì)沉淀法和樣本直接裂解提取法，無論采用哪種方法，最根本的目的是獲得高純度、無干擾雜質(zhì)和盡可能全部的蛋白質(zhì)。然而對(duì)于富含糖蛋白較多的樣品，多糖會(huì)阻礙凝膠孔徑，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀，延長凝聚時(shí)間，或出現(xiàn)水平條紋，對(duì)雙向電泳影響極大（何文錦等，2007）。對(duì)于富含多糖的樣品，目前大多采用高速離心法或透析法去除（Ehling-Schulz et al.，2002），然而由于枸杞細(xì)胞壁不僅富含多種糖蛋白，還含有大量色素和膠質(zhì)等物質(zhì)，因此本研究先用洗脫液采用高速離心法確定是細(xì)胞壁組分，再從細(xì)胞壁組分中提取枸杞細(xì)胞壁蛋白，確保提取的是細(xì)胞壁蛋白而非其他組分的雜蛋白，且避免多糖、色素和膠質(zhì)等物質(zhì)對(duì)電泳的影響。從雙向電泳結(jié)果來看，蛋白質(zhì)樣品內(nèi)少有不溶性細(xì)胞碎片、鹽分、多糖和其他雜質(zhì)，電泳效果較好，達(dá)到后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)的樣品要求;通過液相色譜分析結(jié)果來看，蛋白質(zhì)樣品中的肽段種類較多，復(fù)雜程度較高，且含有低豐度蛋白質(zhì)，所提蛋白質(zhì)中含有明確細(xì)胞壁定位的蛋白質(zhì)。氯化鈣法提取的細(xì)胞壁蛋白已達(dá)到進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)，可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)，開展枸杞果實(shí)細(xì)胞壁差異化蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究，確定與枸杞多糖積累相關(guān)關(guān)鍵蛋白質(zhì)或酶，進(jìn)而闡明蛋白質(zhì)水平上枸杞多糖積累機(jī)制。

4 結(jié)論

運(yùn)用六步洗脫法可去除胞漿蛋白獲得細(xì)胞壁組分，用氯化鈣溶液?jiǎn)为?dú)提取細(xì)胞壁蛋白樣品所得樣品蛋白質(zhì)豐度和質(zhì)量?jī)?yōu)于苯酚提取法、氯化鋰提取法和氯化鈣加氯化鋰結(jié)合提取法，其中選用含有硫脲的裂解液Ⅰ裂解蛋白質(zhì)定量和電泳效果好。氯化鈣提取所得蛋白質(zhì)樣品已達(dá)到后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的樣品要求，氯化鈣提取法為寧夏枸杞果實(shí)細(xì)胞壁蛋白提取的最優(yōu)方法。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）