耐熱保護劑提高雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗保存效果研究

劉青濤 盧鳳英 汪愛芬 尹秀鳳 朱秀同 何平有 趙玉龍 朱曉瑋 薛家賓 張小飛

摘要：為提高雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的耐熱性能，根據前期研究設計了3個耐熱保護劑配方，比較不同配方對疫苗的抗原凍干損失、溫度耐受性和保存期的影響。結果顯示，保護劑TS11、TS37、TS51所制備疫苗的抗原凍干損失均在0.5 lg以下，相互之間差異不明顯。但TS37所制備疫苗在37 ℃和45 ℃耐受后的抗原效價下降滴度明顯低于TS11和TS51，這說明TS37具有更好的耐熱保護效果。另外，25 ℃、2～8 ℃保存試驗顯示，配方TS37可使疫苗在室溫下至少能保存1個月、冷藏條件下至少保存27個月而抗原含量和攻毒保護仍能達到質量標準要求。因此，本試驗研制成功針對雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的耐熱保護劑TS37，該保護劑可使疫苗實現(xiàn)2～8 ℃下長期保存。

關鍵詞：耐熱保護劑;雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗;保存效果

中圖分類號：S852.5 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0152-05

雞新城疫和傳染性支氣管炎是危害我國養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病[1]。雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota+H120株）是目前應用最廣的雞用活疫苗，在預防雞新城疫和傳染性支氣管炎中發(fā)揮了重要作用[2]。但目前國內該疫苗的生產采用以脫脂奶粉和蔗糖為主要成分的常規(guī)凍干保護劑，疫苗必須在-15 ℃以下冷凍保存[3]，在儲存、運輸和使用過程中對冷鏈的要求高，在臨床上常常發(fā)生由于達不到冷鏈要求所導致的疫苗免疫失敗[4]，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經濟損失。而發(fā)達國家生產活疫苗普遍采用耐熱保護劑技術，疫苗只需在2～8 ℃保存，這方便了疫苗的保存和運輸[5-6]。

耐熱保護劑技術是高品質獸用活疫苗制造的關鍵工藝技術，發(fā)達國家早在20世紀80年代就對該技術進行了研究，并且僅被少數跨國巨頭企業(yè)掌握，一直處于保密狀態(tài)[7-8]。雖然我們國家的獸用生物制品廠也對該技術進行了大量研究，但是由于技術封鎖和起步較晚目前能用于規(guī)?；a的獸用耐熱保護劑活疫苗的種類還比較少[9]，特別是能用于雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota+H120株）規(guī)模化生產的耐熱保護劑技術仍然缺乏。為此，筆者于2005—2019年在江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)所和兆豐華生物科技（南京）有限公司針對該疫苗進行了耐熱保護劑研究，對耐熱保護劑對疫苗的溫度耐受性、保存期和免疫保護效果的影響進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 制苗與檢驗用毒種 雞新城疫病毒（La Sota株）和傳染性支氣管炎病毒（H120株）制苗用雞胚液，雞新城疫病毒強毒（CVCC AV1611株），雞傳染性支氣管炎病毒強毒（M41株）;均由兆豐華生物科技（南京）有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 谷氨酸鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司;聚乙烯吡咯烷酮、明膠、蔗糖等，購自Sigma公司。

1.1.3 雞胚與實驗動物 SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司;SPF雞由SPF雞胚孵化，在隔離器內飼養(yǎng)至21日齡用于試驗。

1.2 方法

1.2.1 耐熱保護劑疫苗的制備 在前期篩選的基礎上，用谷氨酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、蔗糖等基質，通過自主開發(fā)的“獸用疫苗耐熱保護劑配方設計軟件”獲得TS11、TS37、TS51這3個保護劑配方。每個配方均有A、B這2個部分組成，A部分主要為不耐熱基質，過濾除菌;B部分由耐熱基質組成，高壓滅菌;A和B按體積比1 ∶ 4混合即為耐熱保護劑。耐熱保護劑與雞新城疫病毒La Sota株雞胚液、雞傳染性支氣管炎病毒H120株雞胚液按體積比 1 ∶ 1 ∶ 1 進行混合，3 mL/瓶，分裝至7 mL西林瓶，進行冷凍干燥。每個配方均制備3批疫苗，對疫苗的抗原凍干損失、溫度耐受性和保存期等進行測定。

1.2.2 冷凍干燥效果檢驗 按照《中國獸藥典》中質量標準的要求對疫苗的外觀、真空度、剩余水分、純凈性、安全性和每羽份抗原含量進行檢驗和測定。

1.2.3 溫度耐受性評價 將疫苗置37 ℃ 7、10、15 d，45 ℃ 3、5 d后，觀察制品的外形并測定疫苗的抗原含量。

1.2.4 保存期測定 將疫苗置25 ℃ 30 d后進行病毒含量測定，同時用雞進行效力檢驗。另外，將疫苗置2～8 ℃條件下保存，分別于3、6、9、12、18、24、27個月后取出，進行病毒含量測定;其中保存24、27個月的疫苗，用雞進行效力檢驗。

1.2.4.1 雞新城疫部分雞效力檢驗方法 采用30日齡的SPF雞15羽，其中10羽各滴鼻接種疫苗0.01羽份，5羽作為對照組，接種后14 d，每羽雞各肌肉注射雞新城疫病毒強毒104.0 ELD50，觀察 14 d，對照雞全部發(fā)病死亡，免疫雞至少保護9羽，則雞新城疫部分判為合格。

1.2.4.2 雞傳染性支氣管炎部分雞效力檢驗方法 采用1～3日齡SPF雞10羽，每羽滴鼻接種疫苗1羽份，接種后10 d，連同對照雞10羽，用10倍稀釋的雞傳染性支氣管炎病毒強毒滴鼻，每羽1～2滴，觀察10 d，對照雞至少發(fā)病8羽，免疫雞至少保護8羽，則雞傳染性支氣管炎部分判為合格。

2 結果與分析

2.1 冷凍干燥結果

根據《中國獸藥典》中質量標準的規(guī)定對3種耐熱保護劑所制備疫苗的各項指標進行測定，由表1可知，3個保護劑配方所制備的9批疫苗的外形、剩余水分、真空度、純凈性和安全性檢驗均合格。由圖1可知，3個保護劑配方所制備疫苗的抗原含量均達到質量標準的要求（新城疫抗原≥6.0 lg/羽份，傳染性支氣管炎抗原≥3.5 lg/羽份）[3]，不同保護劑所制備疫苗的抗原凍干損失差異不明顯，說明3種保護劑配方對雞新城疫和傳染性支氣管炎疫苗抗原均具有良好的冷凍干燥保護效果。

2.2 疫苗的溫度耐受性測定結果

為比較3個配方對疫苗的耐熱保護效果，將各批次疫苗分別置于37 ℃和45 ℃保存，保存一定時間后測定疫苗抗原效價，分析抗原損失情況。由表2可知，TS37所制備的雞新城疫疫苗在37 ℃ 保存 7 d 后抗原效價仍然能達到《中國獸藥典》中質量標準的要求（≥6.0 lg/羽份），而TS11和TS51所制備疫苗在37 ℃保存7 d后抗原效價均下降到6.0 lg/羽份以下;而對于抗原損失的統(tǒng)計分析結果（圖2）顯示，TS37所制備疫苗在37 ℃和45 ℃的抗原損失均顯著低于TS11和TS51所制備疫苗，這說明配方TS37對新城疫抗原的耐熱保護效果優(yōu)于TS11和TS51。由圖2、表3可知，TS37所制備雞傳染性支氣管炎疫苗在37 ℃和45 ℃的抗原損失均顯著低于TS11和TS51所制備疫苗，這說明配方TS37對傳染性支氣管炎抗原的耐熱保護效果也優(yōu)于TS11和TS51。

2.3 疫苗在25 ℃的保存試驗結果

為比較不同耐熱保護劑配方在室溫條件下對疫苗抗原的保護效果，將疫苗置于25 ℃條件下保存 30 d，然后測定疫苗的抗原效價。結果（圖3）顯示，配方TS37所制備疫苗在25 ℃保存30 d雞新城疫與傳染性支氣管炎疫苗抗原的含量均在 6.0 lg/羽份和3.5 lg/羽份以上，而配方TS11和TS51所制備疫苗的2種抗原含量均下降至6.0 lg/羽份和3.5 lg/羽份以下，這進一步說明配方TS37對雞新城疫與傳染性支氣管炎疫苗抗原的耐熱保護效果優(yōu)于TS11和TS51。

2.4 疫苗在2～8 ℃的保存試驗結果

基于疫苗的耐熱效果評價結果，對配方TS37所凍干疫苗在2～8 ℃條件下的保存期進行了測定。由圖4可知，疫苗在2～8 ℃條件下保存12個月雞新城疫抗原效價未下降，18個月后新城疫抗原效價雖然有所下降，但在保存27個月后疫苗抗原效價仍然高于6.0 lg/羽份。而對傳染性支氣管炎抗原的測定結果顯示，疫苗在2～8 ℃條件下保存27個月后，抗原效價仍然高于3.5 lg/羽份。以上結果說明， 配方TS37所凍干的疫苗在2～8 ℃條件下至少可以保存27個月。

2.5 疫苗的攻毒保護效果測定

為進一步確定配方TS37在25 ℃和2～8 ℃條件下對疫苗的保護效果，對在25 ℃保存30 d和2～8 ℃保存24、27個月疫苗的免疫保護效果用攻毒試驗進行了驗證。由表4可知，采用25 ℃保存30 d、2～8 ℃保存24、27個月的疫苗接種雞后可保護雞抵抗新城疫和傳染性支氣管炎病毒強毒株的攻擊。這進一步說明，采用TS37所凍干疫苗在25 ℃至少可以保存30 d，在2～8 ℃至少可保存27個月。

3 討論

疫苗免疫是我國目前進行動物疫病防控的最有效手段，疫苗質量直接關系到我國動物疫病防控的效果[10]。但目前我國獸用疫苗企業(yè)所用的制造技術在先進性上與發(fā)達國家還存在一定差距，特別是在獸用活疫苗耐熱保護劑技術上差距巨大[7-9]。目前能用于規(guī)模化生產、推廣的耐熱保護劑活疫苗的種類并不多，并且主要集中在單苗，耐熱保護劑多聯(lián)活疫苗比較稀缺。對多個疫苗毒株能夠同時提供保護的耐熱保護劑一直是我國獸用疫苗制造行業(yè)難于突破的技術瓶頸。

本試驗在前期研究的基礎上設計了3個耐熱保護劑配方，并比較了3個配方對雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota+H120株）的耐熱保護效果。研究結果表明，配方TS11、TS37、TS51對雞新城疫、傳染性支氣管炎抗原均具有良好的凍干保護效果，凍干過程中的抗原損失均比較低。但是配方TS37所制備的疫苗在耐受高溫后的抗原效價下降滴度要明顯低于配方TS11、TS51，配方TS37具有更好的耐熱保護性能。另外，在25 ℃保存30 d TS37所制備疫苗的抗原效價仍然能達到質量標準的要求，這說明該保護劑配方在室溫條件下對疫苗抗原具有很好的保護效果，這避免了疫苗在臨床應用過程中的抗原損失，有效保證了疫苗的臨床應用效果[10-11]。

活疫苗能夠快速誘發(fā)動物機體的先天性免疫應答和獲得性免疫應答[12-13]，并且可以選擇多種接種途徑（汽霧、飲水、滴鼻、點眼、注射等）進行免疫[14-17]，因此在動物疫病防控中發(fā)揮了不可或缺的作用。但利用常規(guī)保護劑生產的傳統(tǒng)活疫苗必須在-15 ℃以下保存，對冷鏈的要求非常嚴格，這大大限制了活疫苗的應用范圍，并且常常由于保存、運輸不當導致疫苗的抗原效價下降，從而引起免疫失敗和疫病的流行。而本研究通過溫度耐受性試驗篩選出的配方TS37可以使雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗在2～8 ℃條件下的保存期達到27個月，這降低了疫苗在保存、運輸過程中對于冷鏈的要求，可促進獸用活疫苗的推廣利用，降低免疫失敗的發(fā)生率。另外，本研究中配方TS37所制備疫苗在37 ℃保存7～10 d，雞新城疫和傳染性支氣管炎抗原的效價下降均在1 lg之內，因此我們可以把37 ℃保存7～10 d作為疫苗保存期的一個快速測定方法。

綜上所述，本研究中的耐熱保護劑TS37可提高雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的耐熱性能，延長疫苗在室溫條件下的保存期，使疫苗實現(xiàn) 2～8 ℃條件下的長期保存，這減少了疫苗在運輸、儲存、使用過程中的抗原損失，減少了疫苗免疫失敗的發(fā)生，具有良好的應用前景。

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