抗大口黑鱸彈狀病毒中草藥的篩選及抗病毒效果

杭小英 袁雪梅 呂孫建 張海琪 劉莉 于喆 施偉達(dá)

摘要：采用MTT法，選擇黃芪多糖、白花蛇舌草、金銀花、葡萄糖酸鋅、板藍(lán)根、白芍、連翹及黃藤素8種中草藥對(duì)大口黑鱸彈狀病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV）進(jìn)行體外抗病毒試驗(yàn)，并挑選黃芪多糖，利用熒光定量PCR方法研究其對(duì)病毒復(fù)制和宿主細(xì)胞內(nèi)凝集素基因（Intelectin）表達(dá)的影響。體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪多糖抗MSRV效果最好，兼具顯著的阻斷、抑制和中和病毒的效果，其最高阻斷作用率為59.13%，最高抑制率為21.64%，最高中和率為105.46%。同時(shí)，黃芪多糖還可以抑制MSRV的復(fù)制，上調(diào)細(xì)胞Intelectin基因的表達(dá)。另外，連翹、金銀花和白芍對(duì)MSRV分別有顯著的阻斷作用（阻斷作用率為16.92%）、抑制作用（抑制率為21.64%）、中和作用（中和率為54.01%）。結(jié)果表明，黃芪多糖相較試驗(yàn)中其他中草藥制劑具有更好的抗MSRV效果，可為MSRV的藥物防控提供參考。

關(guān)鍵詞：大口黑鱸;彈狀病毒;中草藥;黃芪多糖;MTT法;抗病毒試驗(yàn);Intelectin基因

中圖分類號(hào)： S941.41+9 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）14-0155-05

大口黑鱸（Micropterus salmoides），別稱加州鱸、黑鱸，是太陽(yáng)魚科黑鱸屬魚類，主要棲息在溫暖區(qū)域的湖泊與池塘[1]。大口黑鱸人工繁殖于1983年成功，因其味道鮮美、無(wú)肌間刺，富含蛋白質(zhì)，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，現(xiàn)已推廣到浙江省、江蘇省和廣東省等20多個(gè)?。ㄊ校?。據(jù)《2019中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》報(bào)告，大口黑鱸2018年全國(guó)的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)約43.2萬(wàn)t，成為我國(guó)優(yōu)質(zhì)的特種淡水養(yǎng)殖品種[2]。

近幾年，隨著大口黑鱸養(yǎng)殖行情的上升，養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大，暴發(fā)性疾病也在不斷發(fā)生，其中有一種疾病常在鱸魚幼苗階段暴發(fā)，傳染性強(qiáng)，且死亡率極高。苗種和養(yǎng)殖企業(yè)常用抗菌藥物進(jìn)行治療，但沒(méi)有效果[3]。學(xué)者們通過(guò)對(duì)發(fā)病池塘的病魚進(jìn)行采樣分析，確認(rèn)引起大口黑鱸魚苗出現(xiàn)大規(guī)模死亡的疾病為彈狀病毒病。該病病原為RNA病毒，名為大口黑鱸彈狀病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus，簡(jiǎn)稱MSRV），病毒粒子大小約為53 nm×140 nm，形似子彈，故名彈狀病毒[1]。該病不僅可以通過(guò)養(yǎng)殖水體進(jìn)行水平傳播，也可以通過(guò)親魚繁殖進(jìn)行縱向傳播，極容易傳染，且往往出現(xiàn)病魚后一周內(nèi)全部死亡，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

中草藥（Chinese herb medicine）因富含苷、有機(jī)酸、多糖、生物堿、鞣質(zhì)和黃酮類等有效成分[6]，成為我國(guó)傳染水產(chǎn)病害防治的主要手段之一。相較于西藥，中草藥作為藥劑具有副作用小，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境影響小，不激發(fā)藥源性疾病等優(yōu)勢(shì)，且能通過(guò)不同作用機(jī)制對(duì)病毒產(chǎn)生抑制作用，如阻斷病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合，抑制病毒核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及蛋白合成，抑制病毒釋放等[7]。Wang等發(fā)現(xiàn)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯能阻斷草魚呼腸孤病毒與細(xì)胞表面的受體蛋白結(jié)合，從而達(dá)到抑制病毒的感染目的[8]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯也能抑制白斑綜合征病毒的感染[9]。此外，研究表明中草藥制劑還可以提高機(jī)體的非特異性免疫水平，甚至誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，從而達(dá)到抵抗病毒感染的目的。Haetrakul等發(fā)現(xiàn)，注射扭序花葉片提取物可以提高鯉魚對(duì)CyHV-3的抗性[10]。Balasubramanian等發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對(duì)蝦食用含有印度木橘、苦瓜和狗牙根提取物的飼料后，其對(duì)白斑綜合征病毒的抗性作用得到了顯著提高，其中食用含 100 mg/kg的狗牙根水提取物的飼料可以使斑節(jié)對(duì)蝦攻毒存活率達(dá)100%[11]。

本研究在結(jié)合傳統(tǒng)中草藥理論及相關(guān)抗病毒藥物研究的基礎(chǔ)上，篩選出黃芪多糖、連翹、板藍(lán)根等8種中草藥，測(cè)定以上中草藥對(duì)MSRV的體外抑制作用，從中篩選出有效的抗MSRV中草藥，旨在為大口黑鱸彈狀病毒病防治提供可行且符合市場(chǎng)要求的治療方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用大口黑鱸魚苗購(gòu)自浙江省湖州市某養(yǎng)殖場(chǎng)，MSRV毒株及草魚卵巢細(xì)胞（CO）均由筆者所在單位魚病研究室分離培養(yǎng)保存，黃芪多糖、連翹等中草藥購(gòu)自陜西森弗高科實(shí)業(yè)有限公司。M199培養(yǎng)基、胎牛血清、細(xì)胞生長(zhǎng)液、雙抗（青霉素 100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL）、胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco公司;MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;TRIzol總RNA 提取試劑、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR熒光定量檢測(cè)試劑購(gòu)自 TOYOBO公司。

1.2 試驗(yàn)方法

本研究于2019年1月開始，相關(guān)試驗(yàn)均在浙江省淡水水產(chǎn)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.1 病毒滴度的測(cè)定 病毒滴度檢測(cè)按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法[12]進(jìn)行，CO細(xì)胞用胰酶消化后，按照 1×105/孔的密度加到96孔板，25 ℃培養(yǎng)12 h，待測(cè)病毒經(jīng)10倍梯度稀釋后，加入96孔板中，每孔添加量為100 μL細(xì)胞懸液，每個(gè)稀釋度做8孔重復(fù)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞為陰性對(duì)照，連續(xù)觀察5 d。根據(jù)病變情況，按 Karber 氏法計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）[13]。

1.2.2 黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對(duì)CO細(xì)胞安全濃度的測(cè)定 將8種中草藥分別溶解于雙蒸水，經(jīng)0.22 μm濾膜除菌后保存于4 ℃?zhèn)溆?。采用CPE法測(cè)定黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅、板藍(lán)根、連翹、白芍、黃藤素及白花蛇舌草等8種中草藥對(duì)CO細(xì)胞的最大安全濃度。將藥物倍比稀釋后接種于96孔板中的CO細(xì)胞，每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)，另設(shè)1組正常細(xì)胞對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)96 h，取不引起細(xì)胞病變的最大濃度為該藥物的安全濃度。

1.2.3 黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對(duì)MSRV的阻斷作用測(cè)定 在安全濃度基礎(chǔ)上將8種中草藥分別倍比稀釋成4個(gè)稀釋度，加到長(zhǎng)成單層CO細(xì)胞的96孔板中，按每孔100 μL添加各濃度藥物，每個(gè)稀釋度做4孔重復(fù)孔。在25 ℃孵育4 h后吸走各孔藥物，另加入100 μL 100 TCID50的病毒液，于25 ℃吸附1.5 h，隨后吸去病毒液，加入細(xì)胞維持液，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。25 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察CPE，當(dāng)病毒對(duì)照CPE達(dá)到“+ + +”“+ + + +”時(shí)，記錄CPE情況，并測(cè)定96孔板中細(xì)胞的活性，計(jì)算藥物的作用率。

1.2.4 黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對(duì)MSRV的抑制作用測(cè)定 待96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的CO細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，按每孔100 μL的添加量接種100 TCID50的病毒液，于25 ℃吸附1.5 h，棄去病毒液，加入安全濃度范圍內(nèi)倍比稀釋的中藥提取物，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度做4孔重復(fù)，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。25 ℃培養(yǎng)，記錄方法同“1.2.3”節(jié)，并用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活量，并計(jì)算抑制率，方法和公式同“1.2.3”節(jié)。

1.2.5 黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對(duì)MSRV的中和作用測(cè)定 將8種中草藥安全濃度范圍內(nèi)4個(gè)稀釋度的藥液分別與等體積 100 TCID50 病毒液混合，25 ℃作用2 h，加到長(zhǎng)成單層CO的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度做4孔重復(fù)，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。25 ℃ 中培養(yǎng)，記錄方法同“1.2.3”節(jié)，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活量，計(jì)算中和作用率，方法和公式同“1.2.3”節(jié)。

1.2.6 黃芪多糖對(duì)病毒復(fù)制的影響 分別按照“1.2.3”“1.2.4”“1.2.5”節(jié)中的方法進(jìn)行處理，分為阻斷試驗(yàn)組、抑制試驗(yàn)組和中和試驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)計(jì)等劑量病毒感染CO細(xì)胞的病毒對(duì)照組和正常細(xì)胞對(duì)照組。于病毒接種后6、12、24、48、72 h收集細(xì)胞病毒液，TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄參照TOYOBO公司的“ReverTra Ace qPCR RT Master Mix”試劑盒合成cDNA。應(yīng)用引物MSRV-F/MSRV-R對(duì)樣品cDNA進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序參考之前的研究方法[4]。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到樣品中病毒基因組的拷貝數(shù)。

1.2.7 黃芪多糖對(duì)CO細(xì)胞Intelectin表達(dá)的影響 按照“1.2.6”節(jié)所述步驟處理樣品，分別用引物Intelectin-F/Intelectin-R及β-actin-F/β-actin-R對(duì)樣品cDNA進(jìn)行Real-time PCR，反應(yīng)體系及程序參考之前的研究方法[4]。通過(guò)軟件利用2-ΔΔCT方法計(jì)算各組Intelectin表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)關(guān)系。各試驗(yàn)組和細(xì)胞對(duì)照組之間Intelectin基因的表達(dá)差異分析方法參照“1.2.6”節(jié)進(jìn)行。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 各試驗(yàn)組與病毒對(duì)照組之間的差異用SPSS 16.0中的單因素方差分析法（One-way ANOVA）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSRV TCID50

通過(guò)試驗(yàn)測(cè)得MSRV 滴度為108 TCID50/mL。

2.2 8種中草藥對(duì)CO細(xì)胞的安全濃度

采用CPE方法，測(cè)得黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅、板藍(lán)根、白芍、白花蛇舌草、連翹及黃藤素8種中草藥對(duì)CO細(xì)胞的安全濃度分別為12.500、0.049、0.003、1.560、0.049、3.130、0.012、3.125 mg/mL。

2.3 8種中草藥對(duì)MSRV的阻斷作用效果

8種中草藥對(duì)MSRV的阻斷作用檢測(cè)結(jié)果見表1，對(duì)病毒阻斷效果最好的中草藥為黃芪多糖，其最高阻斷作用率為59.13%，其次為連翹，最高阻斷作用率為16.92%，其他中草藥未表現(xiàn)出明顯的病毒阻斷作用。

2.4 8種中草藥對(duì)MSRV的抑制作用效果

試驗(yàn)測(cè)得黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對(duì)MSRV的抑制作用率結(jié)果見表2，對(duì)病毒抑制效果最好的中草藥為黃芪多糖，其最高抑制率為63.68%，其次為金銀花，最高抑制率為21.64%，其他中草藥未表現(xiàn)出明顯的病毒抑制作用。

2.5 8種中草藥對(duì)MSRV的中和作用效果

試驗(yàn)測(cè)得黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對(duì)MSRV的中和作用率結(jié)果見表3，結(jié)果顯示黃芪多糖、白芍及白花蛇舌草對(duì)病毒均有一定的中和作用，其中中和作用最好的是黃芪多糖，最高中和率可達(dá)105.46%，其次是白芍，最高中和率為54.01%，其他中草藥未表現(xiàn)出明顯的病毒中和作用。

2.6 黃芪多糖對(duì)MSRV復(fù)制的影響

試驗(yàn)結(jié)果見圖1，自24 h起，各試驗(yàn)組病毒的拷貝數(shù)均低于病毒對(duì)照組，但差異不顯著（P>0.05）。

2.7 黃芪多糖對(duì)CO細(xì)胞Intelectin基因表達(dá)的影響

從圖2可以看出，各試驗(yàn)組Intelectin基因的表達(dá)量均出現(xiàn)一個(gè)先升高再降低的趨勢(shì)，其中24 h時(shí)

各試驗(yàn)組細(xì)胞Intelectin基因表達(dá)量均極顯著高于細(xì)胞對(duì)照組（P<0.01），中和試驗(yàn)組在48、72 h時(shí)Intelectin的表達(dá)量仍極顯著高于細(xì)胞對(duì)照組（P<0.01）。

3 討論與結(jié)論

大口黑鱸彈狀病毒病于2015年在浙江地區(qū)發(fā)現(xiàn)，主要感染對(duì)象為大口黑鱸，在親魚及幼苗中均能檢測(cè)到該病毒，且主要在幼苗階段發(fā)病，具有極高的死亡率[1]。中草藥提取物具有天然結(jié)構(gòu)，生物活性較為完整，已被證實(shí)不僅能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝和免疫力，還能提高機(jī)體的抗感染能力[6，14]。本研究選取黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅、板藍(lán)根、白芍、白花蛇舌草、連翹及黃藤素8種中草藥進(jìn)行體外抑制病毒測(cè)試，結(jié)果顯示黃芪多糖對(duì)MSRV具有較高的阻斷、抑制和中和效果。另外，連翹對(duì)MSRV也有一定的阻斷效果，金銀花對(duì)該病毒有一定的抑制和中和效果，但均不如黃芪多糖明顯。本研究驗(yàn)證了以上4種中草藥的抗病毒效果，但黃芪多糖、連翹、金銀花和白芍對(duì)MSRV的抑制機(jī)制不同，這與已有的研究結(jié)果一致。

連翹為木樨科植物，其主要成分連翹酯苷藥理作用廣泛，其中抗病毒療效尤為顯著，對(duì)多種病毒均有一定的抑制效果，包括呼吸道合胞病毒[15]、腺病毒[16]、流感病毒[17]和皰疹病毒[18]等。田文靜等發(fā)現(xiàn)，連翹水提液能夠明顯抑制呼吸道合胞病毒[15]。王岌等用MTT法也觀察到連翹在HEPG2細(xì)胞中也能抑制呼吸道合胞病毒的復(fù)制[19]。本研究顯示，連翹對(duì)MSRV主要表現(xiàn)為阻斷效果，推測(cè)其可能抑制了病毒衣殼蛋白與細(xì)胞受體蛋白結(jié)合的過(guò)程。劉穎娟等也發(fā)現(xiàn)，連翹有效成分在細(xì)胞上對(duì)單純皰疹病毒的復(fù)制能起到阻斷和抑制的作用[18]。金銀花對(duì)MSRV主要表現(xiàn)為抑制作用，可能參與了細(xì)胞對(duì)MSRV病毒的復(fù)制及病毒顆粒裝備過(guò)程的抑制作用。金銀花曾被證明能夠抑制合胞體病毒，金銀花中綠原酸可以下調(diào)細(xì)胞TLR3、TBK1和p-IRF3蛋白，從而起到良好的抗病毒作用[20]。張旋等也證實(shí)，金銀花對(duì)呼吸道合胞病毒的生物合成具有抑制作用[21]。另外，白芍也對(duì)MSRV具有一定的抗病毒作用，主要表現(xiàn)為體外能夠中和病毒，肖尚喜等發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可以提高IFN效價(jià)，具有抗病毒作用，能使水泡性口炎病毒效價(jià)顯著下降[22]。

以上3種中草藥提取物均表現(xiàn)出一定的抗MSRV活性，但均不如黃芪多糖對(duì)MSRV的作用效果明顯，黃芪多糖對(duì)MSRV的最高阻斷作用率為59.13%，最高抑制率為63.68%，最高中和率為105.46%，均明顯高于其他中草藥提取物。另外，熒光定量結(jié)果顯示，黃芪多糖在作用24 h后也表現(xiàn)出對(duì)MSRV的復(fù)制有一定的抑制作用，雖然差異不顯著。黃芪多糖具有較寬的抗病毒譜，對(duì)流感病毒、柯薩奇病毒、皰疹病毒和乙型肝炎病毒等病毒有明顯的抗性[23]。李麗婭等發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能抑制通過(guò)滴鼻感染上流感病毒的小鼠出現(xiàn)明顯的肺炎和病毒增殖[24];黃芪總皂苷、總多糖和總黃酮?jiǎng)t在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)HSV-2333株皰疹病毒的多種抗病毒效應(yīng)，包括殺滅、阻斷，甚至是直接抑制病毒增殖[25];楊潔等研究表明，黃芪多糖能夠抗多株柯薩奇病毒（CVB-A16、CVB-B1、CVB-B3和CVB-B4），其水提液可抑制該病毒敏感細(xì)胞系中的病毒增殖[26]。鄒宇宏等研究發(fā)現(xiàn)，黃芪總苷在抑制乙肝病毒HBV-DNA轉(zhuǎn)染HepG2-2.2.15細(xì)胞表面分泌HBsAg和HBeAg的同時(shí)，還能抑制細(xì)胞增殖[27]。以上研究均說(shuō)明黃芪多糖兼具阻斷感染、抑制病毒增殖和中和病毒的作用，本研究結(jié)果與之一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖還可以顯著提高CO細(xì)胞Intelectin基因的表達(dá)水平，而該基因主要參與細(xì)胞對(duì)病原微生物的識(shí)別、啟動(dòng)機(jī)體的免疫防御等過(guò)程。Podok 等發(fā)現(xiàn)，用CyHV-2感染異育銀鯽后，魚體的Intelectin基因表達(dá)量顯著上調(diào)，推測(cè)其可能參與了病毒的識(shí)別過(guò)程[28];Gu等也發(fā)現(xiàn)，該基因參與了病毒性腦炎誘導(dǎo)的機(jī)體免疫反應(yīng)[29]。

本研究首次篩選了抗MSRV的中草藥，黃芪多糖、連翹、金銀花和白芍均對(duì)MSRV表現(xiàn)出不同機(jī)制的抗病毒作用，其中黃芪多糖的作用效果最為顯著。該研究結(jié)果可為后續(xù)抗大口黑鱸彈狀病毒及其他病毒藥物的篩選提供理論依據(jù)。

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