高效液相色譜法同時(shí)測定黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量

王云龍，劉春生，陳立柱，房 岐

（1.黑龍江省雞西市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江 雞西158100；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102）

黃芩為大宗藥材，源于唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，用于治療各種熱證和濕證[1]，采收時(shí)僅保留地下主根作為藥用部位，地上部分莖、葉、花往往當(dāng)作廢棄物處理，造成大量資源浪費(fèi)。野黃芩苷是黃芩地上部分的主要成分[2－3]，具有抗腫瘤[4]、神經(jīng)保護(hù)[5]、抗炎[6－7]等藥理作用，目前尚無同時(shí)測定黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量的研究。本研究中建立了同時(shí)測定黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量的高效液相色譜法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂和進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC2010 A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；XPE205型電子天平（德國Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；XM－300UVF型智能靜音超聲波清洗機(jī)（小美超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

野黃芩苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為Y24F11Y16967，純度為98.0%）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；黃芩莖、葉、花3批樣品均采自黑龍江省雞西市黃芩栽培基地，采集時(shí)根據(jù)種植面積平均分為3個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域隨機(jī)采取2株，共6株。樣品采集后，每株分別摘取葉和花，除去雜質(zhì)，干燥，得干燥葉和花；莖切段，干燥，得干燥莖。所得樣品經(jīng)雞西市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心楊立志主任藥師鑒定為黃芩的干燥莖、葉和花。樣品來源及相關(guān)信息見表1。

表1 樣品來源及相關(guān)信息Tab.1 Sources and related information of the samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）－0.4 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min時(shí)35%A，15～25 min時(shí)35%A～80%A，25～32 min時(shí)80%A～35%A，32～35 min時(shí)35%A）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：335 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取野黃芩苷對照品24.88 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，即得質(zhì)量濃度為243.82 μg／mL的對照品貯備液，精密吸取4 mL，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，混勻，即得質(zhì)量濃度為97.53 μg／mL的對照品溶液。分別取3號樣品的莖、葉、花，研成細(xì)粉，過4號篩，取莖粉末0.50 g、葉粉末0.13 g、花粉末0.25 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，密塞，靜置30 min，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。取缺黃芩莖、葉、花的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照藥材溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條進(jìn)樣測定。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.scutellarinA.Test solution（stem）B.Test solution（leaf）C.Test solution（flower）D.Reference solution E.Negative reference medicinal material solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下對照品貯備液1，2，4，6，8，10 mL，分別置10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，搖勻，得系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、對照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝25 881X＋93 582(r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，野黃芩苷質(zhì)量濃度在24.38～243.80 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取黃芩葉(3號樣品)，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次。結(jié)果野黃芩苷峰面積的RSD為0.31%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取黃芩葉（3號樣品）0.13 g，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果野黃芩苷含量的RSD為1.53%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取黃芩葉（3號樣品），依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，16，24，48 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果野黃芩苷峰面積的RSD為0.92%（n＝7），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的黃芩葉（3號樣品）粉末65 mg，精密稱定，共6份，分別置50 mL容量瓶中，精密加入2.2項(xiàng)下對照品貯備液10 mL，用70%乙醇定容，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 黃芩葉中野黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of the recovery test of scutellarin in the leaves of Scutellaria baicalensis(n＝6)

2.4 樣品含量測定

分別取3批黃芩莖、葉、花，各3份，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)法計(jì)算野黃芩苷的含量，結(jié)果見表3?？梢姡S芩莖、葉、花中野黃芩苷含量由高至低依次為葉、花、莖，葉中野黃芩苷的含量為莖或花的2～3倍。3批樣品中野黃芩苷含量差異不大，表明生長年限對黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量的影響不顯著。

表3黃芩莖、葉、花中野黃芩苷含量測定結(jié)果（%，n＝3）Tab.3 Content determination of scutellarin in the stems，leaves and flowers of Scutellaria baicalensis（%，n＝3）

3 討論

在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用高效液相色譜法測定時(shí)，黃芩莖、葉、花中野黃芩苷色譜峰的信號較強(qiáng)，故選擇野黃芩苷為檢測指標(biāo)?？疾炝瞬煌崛》椒ǎ?0%乙醇超聲提取、70%乙醇回流提取、甲醇超聲提取、甲醇回流提?。繙y定結(jié)果的影響，結(jié)果以70%乙醇為提取溶劑時(shí)，先靜置30 min，再超聲處理30 min，黃芩莖、葉、花中野黃芩苷的含量最高，考慮超聲提取法簡便，故選擇70%乙醇超聲提取。通過掃描紫外光譜發(fā)現(xiàn)，在335 nm波長下有最大吸收，故選擇335 nm為檢測波長。

前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同樣品黃芩葉含量差異較大，考慮其化學(xué)成分可能受生長時(shí)間和不同生長部位等因素影響，故僅選擇黃芩葉樣品進(jìn)行方法學(xué)考察。黃酮類化合物多顯弱酸性，易解離，影響分離效果，采用離子抑制色譜法加入一定量磷酸，通過梯度洗脫，各色譜峰分離較好。

測定樣品含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，葉中野黃芩苷的含量為莖或花的2～3倍，提示今后制訂黃芩莖、葉、花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)充分考慮莖、葉、花的質(zhì)量比例。生長年限對黃芩莖、葉、花野黃芩苷含量的影響不顯著，其原因可能與每年秋季對莖、葉、花割秧或焚燒處理使次年發(fā)新枝葉有關(guān)。

綜上所述，本方法操作簡便，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可用于黃芩莖、葉、花中野黃芩苷的含量測定，可為今后黃芩地上部分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂和進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。