頂空氣相色譜法測定國產米格列奈鈣原料藥中有機溶劑殘留

李 珉，侯金鳳，劉海濤，車寶泉，李文東

（北京市藥品檢驗所·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室·中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京102206）

米格列奈，化學名為2－（S）－芐基－4－氧代－4－（順－全氫異吲哚－2－基）丁酸，是繼瑞格列奈、那格列奈之后的又一新型苯甲酸衍生物類降糖藥物。2004年由日本Kissei制藥公司研制的米格列奈鈣首次在日本上市[1－3]。米格列奈鈣可通過抑制胰腺B細胞膜上ATP依賴型K＋通道，促進Ca2＋內流，從而增加細胞內Ca2＋濃度，促進胰島素分泌，發(fā)揮降血糖作用，具有起效快、作用時間短、引起低血糖危險性小的優(yōu)點，可單獨用于經飲食和運動療法不能有效控制高血糖的非胰島素依賴型糖尿病患者，又稱“餐時血糖調節(jié)劑”[4－6]。目前，各國藥典中僅《日本藥局方》ⅩⅦ版[7]中收錄了米格列奈鈣原料，但其標準中未設置殘留溶劑項目。國內各企業(yè)所產米格列奈鈣原料分別執(zhí)行不同的標準[8－11]控制不同溶劑殘留。在已有文獻報道中，米格列奈鈣殘留溶劑的檢測方法均未能完全覆蓋各企業(yè)[12－13]。本研究中針對撰寫時在產的5家國內企業(yè)使用的9種殘留溶劑，建立了統(tǒng)一的米格列奈鈣殘留溶劑的測定方法，并對國內上市產品進行了評價。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890型氣相色譜儀，包括火焰離子化檢測器（FID）、7697A型頂空進樣器（美國Agilent公司）；XA205型電子天平（瑞士MettlerToledo公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

米格列奈鈣原料樣品(企業(yè)A，批號分別為0320160401，0320160501，0320160601；企業(yè)B，批號分別為01616015，01616021，01616022；企業(yè)C，批號分別為150801，150802，150803；企業(yè)D，批號分別為MG－161101，MG－161102，MG－160403；企業(yè)E，批號分別為170401Y，170402Y，170403Y）。甲 醇（批 號 為20150717）、無水乙醇（批號為20150717）、異丙醇（批號為20110803）、乙腈（批號為20141105）、二氯甲烷（批號為20150710）、正己烷（批號為20150723）、乙酸乙酯（批號為20120222）、四氫呋喃（批號為20141109）和三乙胺（批號為20110905），均購自國藥集團化學試劑有限公司，均為色標對照品，含量均為100%；二甲基亞砜為色譜純（美國Merck公司）；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 氣相色譜條件

色譜柱：Agilent DB－624毛細管柱（以6%氰丙基苯基－94%二甲基聚硅氧烷為固定液，60 m×0.53 mm，3 μm）；柱溫：程序升溫，初始柱溫為40℃、維持12 min，以5℃／min的速率升至80℃、維持5 min，再以50℃／min的速率升至200℃、維持15 min；進樣口溫度：220℃；頂空瓶平衡溫度：80℃；平衡時間：30 min；進樣時間：1 min；載氣：高純度氮氣；載氣流速：1.0 mL／min；分流比：10∶1；檢測器：FID；檢測器溫度：250℃。

2.2 溶液制備

分別取甲醇300 mg、乙醇500 mg、異丙醇500 mg、乙腈41 mg、二氯甲烷60 mg、正己烷29 mg、乙酸乙酯500 mg、四氫呋喃72 mg和三乙胺20 mg，精密稱定，置同一100 mL容量瓶中，用二甲基亞砜溶解并定容，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，用二甲基亞砜定容，搖勻，即得混合對照品溶液。取樣品約100 mg，精密稱定，置頂空瓶中，精密加入二甲基亞砜1 mL，密封，即得供試品溶液。取二甲基亞砜作為空白溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取上述混合對照品溶液、空白溶劑各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖(見圖1)。各成分色譜峰分離度均大于2.9，基線分離良好，無干擾峰，表明專屬性良好。

圖1 空白溶液及對照品溶液高效液相色譜圖1.methanol 2.ethanol 3.isopropanol 4.acetonitrile 5.dichloromethane 6.n－h(huán)exane 7.ethyl acetate 8.tetrahydrofuran 9.triethylamine A.Blank solution B.Reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of blank solution and reference solution

線性關系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品貯備液適量，以二甲基亞砜制成系列混合對照品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，mg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程和線性范圍。結果見表1。

表1 線性關系考察結果Tab.1 Results of the linear relation test

檢測限與定量限考察：分別精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比為3∶1和10∶1分別計算檢測限和定量限。結果見表2。

表2 檢測限和定量限考察結果Tab.2 Results of LOD and LOQ

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺峰面積的RSD分別為5.07%，5.46%，5.16%，5.14%，3.91%，4.71%，3.77%，3.75%，4.62%（n＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（企業(yè)A，批號為0320160401）適量，共9份，每份100 mg，分別加入一定質量濃度的混合對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery test（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定。結果均未檢出任何有機溶劑殘留。詳見圖2。

圖2 供試品溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of test solution

3 討論

目前各國藥典中，即使是唯一收錄了米格列奈鈣原料的ⅩⅦ版《日本藥局方》[7]中也未設置殘留溶劑項目。國內各家企業(yè)生產時均執(zhí)行不同的標準[8－11]控制不同殘留溶劑。由于各企業(yè)生產工藝中所使用的有機溶劑不同，本文作者與目前國內擁有米格列奈鈣生產批準文號的6家生產企業(yè)進行了溝通，對在產5家企業(yè)工藝中使用到的溶劑進行了匯總。

本研究中，除三乙胺(未收錄)外，各溶劑均按2020年版《中國藥典(四部)》通則0861殘留溶劑測定法中規(guī)定的限度來折算并制備[14]。而在2020年版《中國藥典（二部）》中，存在3個品種的殘留溶劑中包含了三乙胺。分別為齊多夫定項下三乙胺限度為0.02%[15]481－482，拉米夫定項下三乙胺限度為0.032%[15]774－775，羅紅霉素項下三乙胺限度為0.032%[15]797－799。根據最低限度折算對照品溶液中三乙胺的濃度，并進行制備。對新建方法靈敏度進行驗證，除三乙胺外，各殘留溶劑的定量限均低于前述規(guī)定限度的1／20，檢測限均低于規(guī)定限度的1／100。而三乙胺定量限和檢測限分別為2020年版《中國藥典（二部）》中最低限度0.02%的1／20和1／50，該結果表明新建方法靈敏度較高。

本研究中建立的頂空氣相色譜法可測定米格列奈鈣原料中9種殘留溶劑含量，經方法學驗證，該方法靈敏度高，專屬性、精密度、準確度等均符合分析需求。采用該方法對5家國內企業(yè)的15批次產品進行了殘留溶劑測定，各企業(yè)產品均未檢出殘留溶劑。該結果表明國內各企業(yè)米格列奈鈣產品的溶劑殘留較少，工藝控制較好。