不同炮制方法對吳茱萸生物堿類有效成分含量的影響*

陳 路，馮世鑫，蔣 妮，宋利沙，白隆華，陳乾平

（廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧530023）

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果實，主產(chǎn)于廣西、貴州、云南等地，具有散寒止痛、降逆止嘔等功效[1]。其含有多種化學(xué)成分，目前從中分離的主要有生物堿、檸檬苦素類、揮發(fā)油等成分，生物堿類成分是吳茱萸主要有效成分之一，其中吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量較高，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[2－7]。吳茱萸在臨床應(yīng)用中多用生品和炮制品，但不同炮制方法對吳茱萸生物堿的含量影響較大。中藥的炮制可改變其性味歸經(jīng)和有效成分，進(jìn)而影響藥理作用和臨床應(yīng)用效果[8]。本研究中對吳茱萸生品及黃連水炒吳茱萸、熱水浸吳茱萸、黃連制吳茱萸3種炮制品中的生物堿含量進(jìn)行分析，為該藥材的臨床應(yīng)用提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Varian 210型高效液相色譜儀（美國Varian公司）；SB－5200D型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；BSA124S型電子分析天平（德國Sartoriu公司，精度為萬分之一）；UV－1240型紫外－可見光光度計（日本Shimadzu公司）。

1.2 試藥

吳茱萸堿對照品（批號為110802－201710，含量為99.6%），吳茱萸次堿對照品（批號為110801－201608，含量為99.7%），去氫吳茱萸堿對照品（批號為20531－201703，含量為98%），均購自中國食品藥品檢定研究院；吳茱萸卡品堿對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號為CHB170224）；吳茱萸藥材采自廣西馬山縣周鹿鎮(zhèn)吳茱萸種植基地，經(jīng)廣西藥用植物園彭玉德高級工程師鑒定為正品，批號分別為202006，202007，202008，分別編號為A1，A2，A3；黃連（南寧生源中藥飲片有限公司，批號為20191206）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC－C18柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；檢測波長：330 nm；流速：0.8 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃；流動相：乙腈（A）－0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～3 min時5%A，3～10 min時5%A→10%A，10～15 min時10%A→15%A，15～23 min時15%A→25%A，23～26 min時25%A→50%A，26～30 min時50%A→80%A，30～35 min時80%A→100%A）[9]。此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.evodiamine 2.rutaecarpine 3.dehydroarutaecarpine 4.evocarpine A.Mixed reference solution B.Raw Euodiae Fructus solution C.Stir－fried Euodiae Fructus with water decoction of Coptidis Rhizoma solution D.Soaking Euodiae Fructus in hot water solution E.Fried Euodiae Fructus with Coptidis Rhizoma solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 吳茱萸炮制品制備

黃連水炒吳茱萸[10]：取黃連飲片10 g，加5倍量水，煎煮3次，過濾，合并水煎液，濃縮至20 mL；另取凈吳茱萸（A1）100 g，加2倍量沸水，浸潤2 h，取出，曬干，置銅鍋內(nèi)，加黃連水于150℃噴炒8 min，即得。

黃連制吳茱萸[11－12]：取黃連飲片5 g，加5倍量水，煎煮3次，過濾，合并水煎液，濃縮至120 mL；另取凈吳茱萸（A1）100 g，將黃連汁趁熱倒入，燜潤2 h，炒至微干，取出，晾曬至干，即得。

熱水浸吳茱萸：取凈吳茱萸（A1）100 g，加2倍量沸水，浸潤2 h，取出，晾曬至干，即得。

2.3 溶液制備

供試品溶液[13－14]：取吳茱萸生品及其不同炮制品適量，粉碎后過3號篩，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理40 min，冷卻后再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過，即得。

混合對照品溶液：取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和吳茱萸卡品堿對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.0482，1.3526，0.2042，0.5061mg／mL的對照品貯備液。取上述對照品貯備液各適量，加甲醇制成一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項下各對照品貯備液1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，注入色譜儀，按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以各成分峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、含量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程(見表1)。結(jié)果表明，各成分含量均在各自范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 吳茱萸中4種生物堿線性關(guān)系考察與精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of linear relation，precision，stability and repeatability tests of four alkaloids in Euodiae Fructus（n＝6）

精密度試驗：取2.3項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件，同一時間內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d重復(fù)進(jìn)樣6次，考察日間精密度。結(jié)果4種成分峰面積日內(nèi)精密度的RSD介于0.65%～0.81%（n＝6），日 間 精 密 度 的RSD介 于1.16%～1.75%（n＝6），表明儀器精密度良好。詳見表1。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（編號為A1）樣品，依法制備供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果各成分峰面積的RSD介于0.82%～1.36%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。詳見表1。

重復(fù)性試驗：取同一批（編號為A1）樣品粉末0.5 g，精密稱定，平行6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果各成分峰面積的RSD介于0.94%～1.16%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。詳見表1。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（編號為A1）粉末0.25 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入2.3項下混合對照品貯備液各1.0 mL，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果各成分平均加樣回收率介于98.29%～99.06%，RSD介于1.96%～2.79%(n＝6)。詳見表2。

表2 吳茱萸生品中4種生物堿加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of the recovery tests of four alkaloids in raw Euodiae Fructus（n＝6）

檢測限與定量限考察：取2.3項下混合對照品溶液適量，以甲醇逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以信噪比(S／N)為3∶1和10∶1計算檢測限和定量限。結(jié)果去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿的檢測限分別為8.62，13.70，4.64，7.31 ng，定量限分別為26.82，46.78，14.20，23.54 ng。

2.5 樣品含量測定

取2.3項下供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算并比較各炮制品及生品生物堿的含量。結(jié)果其含量依次降低，黃連水炒吳茱萸＞黃連制吳茱萸＞生品＞熱水浸吳茱萸。詳見表3?？梢?，熱水浸吳茱萸會使其生物堿含量降低，黃連水炒吳茱萸的生物堿含量提升約16.87%。吳茱萸炮制前后生物堿含量比較結(jié)果見圖2。

表3 吳茱萸及其炮制品中生物堿含量測定結(jié)果（mg／g）Tab.3 Content determination of alkaloids in the raw and processed products of Euodiae Fructus（mg／g）

圖2 吳茱萸生品及其炮制品中生物堿含量比較Fig.2 Comparison of alkaloids in the raw and processed products of Euodiae Fructus

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

考察了體積分?jǐn)?shù)為20%，30%，50%，70%，90%的乙醇作為提取溶劑時對4種成分提取率的影響，結(jié)果提取溶劑選擇體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇時4種成分提取率最大，故選用70%乙醇作為提取溶劑。

3.2 流動相選擇

參考2015年版《中國藥典(一部)》中吳茱萸含量測定項下方法，曾選用乙腈－四氫呋喃－0.1%磷酸溶液作流動相，但未能測定去氫吳茱萸堿及吳茱萸卡品堿的含量；考察了乙腈－水[15]、甲醇－乙腈－0.1%磷酸溶液[16]、乙腈－0.1%磷酸溶液和0.05%三乙胺溶液[17]、乙腈－0.1%甲酸溶液等為流動相時對4種成分分離效果的影響，最終參考文獻(xiàn)[9]，以乙腈－0.1%甲酸為流動相，4種生物堿類成分的分離效果最好，基線平穩(wěn)，系統(tǒng)壓力低。

3.3 色譜柱選擇

曾采用Agilent XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Kromasil 100－5 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），AgilentPoroshell120EC－C18柱（100mm×4.6mm，2.7μm）等進(jìn)行測定，以Agilent XDB C18柱測得樣品溶液的峰形雖好，但其保留時間較長，故未被采用；而Kromasil 100－5 C18柱測得樣品溶液的保留時間雖合適，但峰形較差，故不作選擇；Agilent Poroshell 120 EC－C18柱測得樣品溶液中4種生物堿類成分的保留時間合適，峰形和分離度均良好，符合《中國藥典》規(guī)定。

3.4 方法評價

本研究中驗證了高效液相色譜法測定吳茱萸中4種生物堿類成分的可行性，方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好，同時也說明不同炮制方法對吳茱萸生物堿含量有一定影響，進(jìn)一步闡釋了不同炮制品在臨床的應(yīng)用應(yīng)各有側(cè)重，可為吳茱萸的規(guī)范炮制提供參考。