不同滅菌方法對桑葉超微粉中蘆丁含量的影響*

蔣振華，李勝容，王賢英

（重慶市中藥研究院，重慶400065）

桑葉為?？浦参锷orus albaL.的葉，味甘、苦，性寒，歸肺、肝經(jīng)，可除寒熱、出汗，治勞熱咳嗽、明目長發(fā)，用于治療風熱感冒、肺熱燥咳、頭昏頭痛、目赤昏花[1]。桑葉含有蘆丁、槲皮素、異槲皮苷、黃芪苷、茵芋苷等黃酮類成分[2]。桑葉中的總黃酮對糖尿病大鼠小腸的雙糖酶、體外蛋白糖基化及低密度脂蛋白氧化都具有抑制作用[3－5]，具有降血壓、抑制血糖上升、抗菌、消炎、調(diào)血脂、延緩衰老、抗腫瘤、抗氧化等功效[6－7]。桑葉超微粉由桑葉炮制加工而成，但其中的微生物生長繁殖影響產(chǎn)品質(zhì)量，甚至部分有害微生物通過口服進入人體會影響患者的健康和生命安全。因此，對桑葉超微粉的滅菌方法進行研究及控制其微生物限度是必然要求[8]。傳統(tǒng)的滅菌方法可能破壞藥物的有效成分，影響療效；或有輻射、有機溶劑殘留，影響用藥安全；或能耗大、時間長，影響經(jīng)濟效益。滅菌時必須結(jié)合藥物的化學成分、性質(zhì)、劑型等綜合考慮，采用有效的滅菌方法，合理運用滅菌技術[9]，既要除去或殺滅微生物，又要保證藥物的質(zhì)量穩(wěn)定性、治療作用及用藥安全。蘆丁是桑葉中黃酮類成分之一，本研究中探討了不同滅菌方法對桑葉超微粉中蘆丁含量的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

YX280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；MS205DU型電子分析天平(精度為十萬分之一)，XPR6UD5型電子分析開平(精度為百萬分之一)，均購自瑞士梅特勒－托利多有限責任公司；KQ－3200B型超聲波清洗儀（鞏義市予華儀器有限責任公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；M1－L213C型美的微波爐（美的電器有限公司）；Waters e2965型高效液相色譜儀（美國沃特世儀器有限公司），配有Waters 2489型紫外檢測器；101A－1型數(shù)顯電熱鼓風干燥箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）；LCF－G／A－20型壁掛式臭氧消毒機（河北蘭蒂斯環(huán)?？萍加邢薰荆?；SPX－150BⅢ型需氧菌培養(yǎng)箱，CJ－1S型超凈工作臺，SPX－150BⅢ型霉菌及酵母菌恒溫培養(yǎng)箱，均購于天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，美國Fisher公司，批號為20034）；甲醇（批號為20180901），磷酸（批號為20180701），均為分析純，購于重慶川東化工有限公司；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100080－201811，純度為92.2%）；環(huán)氧乙烷；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號為20180201），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號為20180402），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號為20180503），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號為20180201），均購于北京三藥科技開發(fā)公司；桑葉超微粉(批號為20190501)，由山東南易辰超微粉碎技術有限公司制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 滅菌樣品制備

分別用干熱滅菌、濕熱滅菌、輻照滅菌、微波滅菌[10]、臭氧滅菌[11]和環(huán)氧乙烷氣體滅菌方法制備桑葉超微粉的滅菌樣品。干熱滅菌：烘箱160～170℃滅菌120 min；濕熱滅菌：高壓蒸氣121℃滅菌20 min；輻照滅菌：60Co射線6 kGy輻照滅菌；微波滅菌法：滅菌功率600 W微波滅菌2～4 min；臭氧滅菌：經(jīng)臭氧發(fā)生器滅菌30 min；環(huán)氧乙烷氣體滅菌：經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌30 min。

2.2 微生物限度檢查

按2020年版《中國藥典（四部）》通則1108中藥飲片微生物限度檢查法進行試驗。樣品經(jīng)不同方法滅菌，分別將原粉定為1號，干熱滅菌定為2號，濕熱滅菌定為3號，60Co輻照滅菌定為4號，微波滅菌定為5號，臭氧滅菌定為6號，環(huán)氧乙烷滅菌定為7號。微生物限度檢查方法為平皿法，結(jié)果各滅菌樣品均達到預期滅菌效果。詳見表1。

表1 不同滅菌方法桑葉超微粉的微生物限度檢查結(jié)果Tab.1 Results of microbial limit test of ultra－fine powder of Folium Mori with different sterilization methods

2.3 蘆丁含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：ThermoHypersilODSC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）－0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脫程序見表2；流速：1.0 mL／min；檢測波長：358 nm；柱溫：25℃；檢測器：紫外檢測器；進樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

表2 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.2 Gradient elution procedure of mobile phase（%）

圖1 高效液相色譜圖1.rutinA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.3.2 溶液制備

取蘆丁對照品0.0250g，精密稱定，置100mL容量瓶中，用甲醇定容至100mL，配制成質(zhì)量濃度為0.25mg／mL的標準貯備液。分別取1－7號樣品1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾渣用甲醇50 mL同法提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)微孔濾膜濾過（0.45 μm），即得供試品溶液1－7。

2.3.3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取0.20，0.40，1.00，2.00，4.00 mL標準貯備液，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為5，10，25，50，100 μg／mL的系列對照品溶液。按2.3.1項下色譜條件進樣測定，以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X，μg／mL）、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝18 450X－3 339.4，R2＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在5～100 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取對照品溶液（質(zhì)量濃度為10 μg／mL），按2.3.1項下色譜條件進樣測定6次。結(jié)果的RSD為1.81%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.3.2項下供試品溶液1，分別于室溫下放置0，4，8，12，24，36 h時各進樣10 μL測定。結(jié)果峰面積的RSD為1.08%（n＝6），表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取1號樣品1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，共6份，按2.3.1項下色譜條件進樣10 μL測定峰面積，并計算蘆丁含量。結(jié)果蘆丁的平均含量為0.15%，RSD為1.56%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的1號樣品1 g，精密稱定，共9份，分成3組，分別精密加入蘆丁對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.25 mg／mL）3.0，6.0，9.0 mL，依法制備供試品溶液。按2.3.1項下色譜條件進樣測定，并計算回收率。結(jié)果蘆丁的平均回收率為98.12%，RSD為1.43%（n＝9）。

2.3.4 樣品含量測定

分別取對照品溶液和供試品溶液1－7各10 μL，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，并計算蘆丁含量。結(jié)果見表3。

3 討論

由表1可知，6種滅菌條件的微生物限度檢查結(jié)果均符合藥品微生物限度標準規(guī)定，但濕熱滅菌的外觀及色澤較差，其他滅菌方法的效果較好。由表3可知，蘆丁在濕熱滅菌下?lián)p失較大，其他5種滅菌方法對蘆丁含量影響不明顯。考慮到干熱滅菌時間較長，輻照滅菌、臭氧滅菌及環(huán)氧乙烷滅菌存在殘留問題，微波滅菌法因其滅菌時間短，熱轉(zhuǎn)化效率高，節(jié)約能源，符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，并可實現(xiàn)自動控制及連續(xù)化生產(chǎn)[12－13]。故選擇微波滅菌。

表3 不同滅菌方法桑葉超微粉中蘆丁含量測定結(jié)果（%）Tab.3 Content determination of rutin from ultra－fine powder of Folium Mori with different sterilization methods（%）

本試驗中對未滅菌及6種滅菌方法[14－19]的樣品進行了含量測定，結(jié)果顯示，不同滅菌方法對桑葉超微粉的質(zhì)量影響較大。因此，在生產(chǎn)過程中，應對直接服用的中藥飲片桑葉超微粉滅菌方法的選擇進行考察。以蘆丁為指標性成分進行考察，方法穩(wěn)定、可靠、重復性好，可作為桑葉超微粉中蘆丁的含量測定方法，同時為制訂中藥飲片桑葉超微粉的質(zhì)量標準提供參考。

試驗結(jié)果表明，桑葉超微粉濕熱滅菌法對桑葉超微粉蘆丁含量影響較大，其他方法影響較小，而蘆丁是主要藥用成分之一，含量太低不能保證桑葉超微粉的質(zhì)量，故不能選濕熱滅菌方法滅菌；且60Co輻照滅菌存在輻照殘留問題[20－24]，還有待進一步研究。微波滅菌時對物料內(nèi)外同時進行加熱，內(nèi)部溫度高，熱傳導是由內(nèi)向外的，升溫均勻且加熱迅速，時間較短。