川貝母藥理作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

周金龍，李蘩漪，金 晶△

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830054）

川貝母為百合科貝母屬多種植物的干燥鱗莖，有清 熱潤(rùn)肺、化痰止咳功效[1]。近年來(lái)，隨著高通量組學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、藥理學(xué)及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索技術(shù)的日益完善，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的不斷加強(qiáng)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)從系統(tǒng)生物學(xué)角度闡述復(fù)方制劑的作用原理的臨床及基礎(chǔ)研究逐漸增多[2－4]。本研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出川貝母的活性成分與作用靶點(diǎn)，通過(guò)核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，探討其藥理學(xué)作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點(diǎn)篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）（http：／／tcmspw.com／index.php）收集川貝母的有效化學(xué)成分，根據(jù)Lipinski規(guī)則（LR）、口服生物利用度（OB）及藥物相似性（DL）鑒定潛在的生物活性成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)[5]篩選出候選成分及其可能有效的化學(xué)成分。

1.2 活性成分－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的川貝母活性成分導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／uniprot.org／）進(jìn)行靶點(diǎn)－基因名轉(zhuǎn)換，將轉(zhuǎn)換后的靶點(diǎn)通過(guò)零代碼功能富集分析（DAVID）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／david.abcc.ncifcrf.gov／）及BATMAN－TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／bionet.ncpsb.org／batman－tcm／），進(jìn)行KEGG信號(hào)通路與GO生物學(xué)富集分析，以P＜0.05為條件進(jìn)行靶基因篩選，分析川貝母發(fā)揮藥理作用的主要信號(hào)通路及生物過(guò)程。

1.3 靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選得到的靶基因在蛋白相互作用（string）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／string－db.org／）構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）模型，以明確川貝母靶基因之間的相互作用，將蛋白種類設(shè)為“Homo sapiens”進(jìn)行操作，最低相互作用閾值設(shè)為“medium confidence”，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。將PPI模 型 導(dǎo) 入Cytoscape 3.5.1軟 件，運(yùn) 用“Network Analysis”功能進(jìn)行分析。依據(jù)度值(degree)、介數(shù)確定川貝母關(guān)鍵靶基因。詳見(jiàn)表1。

表1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的數(shù)據(jù)來(lái)源Tab.1 Sources of the data of network pharmacology

2 結(jié)果

2.1 川貝母活性成分分析

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果，以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為條件進(jìn)行篩選，去除重復(fù)的化合物，得到可能有效的活性成分13種。詳見(jiàn)表2。

表2 川貝母的活性成分Tab.2 The active ingredients of Fritillaria cirrhosa

2.2 川貝母作用靶點(diǎn)篩選

以“human”為檢索條件，將PubChem CID提交到BATMAN－TCM數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得63個(gè)靶基因，并根據(jù)匹配度由高到低進(jìn)行排序，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到40個(gè)匹配度＞0.5的靶基因。詳見(jiàn)圖1及表3。

表3 川貝母主要活性成分對(duì)應(yīng)靶基因Tab.3 Target genes corresponding to main active ingredients of Fritillaria cirrhosa

圖1 川貝母活性成分Fig.1 The active ingredients of Fritillaria cirrhosa

2.3 生物信息學(xué)分析

將篩選得到的62個(gè)靶基因輸入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO及KEGG富集分析。

GO富集分析：共獲得165個(gè)生物過(guò)程（BP）、35個(gè)細(xì) 胞 組 分（CC）、51個(gè) 分 子 功 能（MF）。其 中，60種BP、26種CC、42種MF顯著富集（P＜0.05），前20位詳見(jiàn)圖2至圖4。

圖2 川貝母靶基因GO分析BP散點(diǎn)圖（前20位）Fig.2 BP scatter diagram of GO analysis of target gene of Fritillaria cirrhosa（top 20）

圖4 川貝母靶基因GO分析MF散點(diǎn)圖（前20位）Fig.4 MF scatter diagram of target gene GO analysis of Fritillaria cirrhosa（top 20）

KEGG通路富集分析：在設(shè)定預(yù)測(cè)候選目標(biāo)得分（≥20分）的情況下，將檢索得到的靶基因作為候選靶點(diǎn)，共得到65條信號(hào)通路，53條通路顯著富集（P＜0.05），前20位詳見(jiàn)圖5。

圖5 川貝母靶基因KEGG分析CC散點(diǎn)圖（前20位）Fig.5 CC scatter diagram of target gene KEGG analysis of Fritillaria cirrhosa（top 20）

2.4 疾病富集分析

疾病種類分類：DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)將篩選得到的靶基因富集分析后獲得344種可能具有治療作用的疾病，其中303種疾病有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），包括3種肺部相關(guān)疾?。宰枞苑渭膊?、肺癌及哮喘)，1種炎性疾?。ǜ腥荆l(fā)炎）。前20位詳見(jiàn)表4。

表4 川貝母可能治療的疾病種類（前20位）Tab.4 Possible diseases treated by Fritillaria cirrhosa（Top 20）

OMIM／TTD分析：BATMAN－TCM數(shù)據(jù)庫(kù)將篩選得到的靶基因進(jìn)行OMIM分析（http：／／www.omim.org）／TTD分析，OMIM分析獲得110種疾病，其中92種疾病顯著富集（P＜0.05），前20種詳見(jiàn)表5；TTD分析獲得119種疾病，其中4種疾病顯著富集（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表5 川貝母靶點(diǎn)治療疾病OMIM分析（前20位）Tab.5 OMIM analysis of target diseases of Fritillaria cirrhosa（Top 20）

表6 川貝母靶點(diǎn)治療疾病TTD分析Tab.6 TTD analysis of target diseases of Fritillaria cirrhosa

潛在活性成分靶標(biāo)途徑／疾病關(guān)聯(lián)分析：根據(jù)已知和預(yù)測(cè)的候選目標(biāo)蛋白繪制PPI圖，其得分不小于每個(gè)查詢TCM成分的20分，在“簡(jiǎn)化網(wǎng)絡(luò)視圖”中，僅顯示顯著富集KEGG途徑和OMIM／TTD疾病表型。川貝母靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖含有333個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 439條邊，其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。將得到的PPI數(shù)據(jù)從BATMAN數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出，詳見(jiàn)圖6。

圖3 川貝母靶基因GO分析CC散點(diǎn)圖（前20位）Fig.3 CC scatter diagram of target gene GO analysis of Fritillaria cirrhosa（top 20）

圖6 川貝母靶點(diǎn)PPI圖Fig.6 PPI network diagram of Fritillaria cirrhosa targets

2.5 靶點(diǎn)PPI分析

利用Cytoscape3.5.1軟件繪制PPI圖，通過(guò)Cytohubba插件鑒定川貝母的關(guān)鍵蛋白，其中綠色表示川貝母有效化合物；核心化合物成分為β－谷甾醇，藍(lán)色表示作用靶基因，共40個(gè)靶基因，篩選出度值＞10的核心基因11個(gè)，其中轉(zhuǎn)錄因子AP－1(JUN)、半胱天冬酶3(CASP3)及熱休克蛋白90基因(HSP90AA1)這3個(gè)基因度值最高，詳見(jiàn)表7及圖7；完成前15位主要靶基因形成PPI圖，詳見(jiàn)圖8；完成前15位主要靶基因與化合物形成相互作用圖，詳見(jiàn)圖9；最后，利用40個(gè)靶基因完成PPT圖，詳見(jiàn)圖10（每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1個(gè)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)中的螺旋代表該蛋白的結(jié)構(gòu)）。

圖7 川貝母化合物網(wǎng)絡(luò)相互作用圖Fig.7 Interaction network diagram of the compounds of Fritillaria cirrhosa

圖8 前15位主要靶基因相互作用Cyto－degree圖Fig.8 Cyto－degree diagram of the top 15 main target genes interactions

圖9 前15位主要靶基因與化合物相鄰及擴(kuò)展圖Fig.9 Cyto－degree neighbors and expanded diagram of the top 15 main target genes and compounds

圖10 40個(gè)靶基因網(wǎng)絡(luò)相互作用圖Fig.10 Interaction network of 40 target genes

表7 川貝母作用的核心基因Tab.7 Core genes of Fritillaria cirrhosa

3 討論

單味中藥的組分成分復(fù)雜，在以“辨證”為原則的治療理念下其化學(xué)成分起效機(jī)制一直不能被客觀證實(shí)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在多個(gè)公共網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上客觀反映了生物大分子與化學(xué)成分間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，將生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)與藥物作用網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，提供了探究藥物與疾病相互作用機(jī)制的文獻(xiàn)基礎(chǔ)，與復(fù)雜疾病的治療理念相吻合，被廣泛用于中藥潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及中藥作用機(jī)制的闡述，按“疾病表型－生物分子網(wǎng)絡(luò)”的思路，能充分、準(zhǔn)確、形象地展現(xiàn)中藥多成分作用于多靶點(diǎn)、多通路的過(guò)程，揭示中藥作用于疾病的機(jī)制[6]。近年來(lái)，較多學(xué)者均以單味藥或復(fù)方通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究其治療疾病的機(jī)制，探討其治療有效性[7－8]。本研究中通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出川貝母的有效化學(xué)成分，為更有針對(duì)性的單體研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

本研究中，共篩選出川貝母的13種化學(xué)成分，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換后，共獲得40個(gè)有效靶基因。將篩選的川貝母有效基因靶點(diǎn)利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中Functional Annotation分析工具對(duì)川貝母的作用靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析及通路分析，結(jié)果川貝母可能通過(guò)影響60種BP、26種CC、42種MF對(duì)刺激神經(jīng)組織的配體－受體相互作用信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、嗎啡成癮、癌癥相關(guān)通路、膽堿能突觸等53個(gè)通路有作用，其中與交感神經(jīng)遞質(zhì)和受體相關(guān)通路5條，即鈣離子信號(hào)通路、嗎啡成癮通路、尼古丁成癮、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)傳導(dǎo)、心肌細(xì)胞中的腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)；與神經(jīng)代謝相關(guān)通路4條，即刺激神經(jīng)組織的配體－受體相互作用信號(hào)通路、膽堿能突觸、5－羥色胺能突觸、γ－氨基丁酸（GABA）能突觸；與激素相關(guān)通路3條，即環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟；與腫瘤相關(guān)通路3條，即癌癥相關(guān)通路、腸癌通路、前列腺癌通路；與肝臟疾病相關(guān)通路2條，即乙型肝炎及非酒精性脂肪肝??；其他類通路3條，即細(xì)胞凋亡、唾液分泌及脂肪細(xì)胞中脂解的調(diào)控。

神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體和配體的集合[9]。潘玲珍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用地西泮能使神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路中16個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，可能與長(zhǎng)期使用地西泮導(dǎo)致機(jī)體所產(chǎn)生的藥品不良反應(yīng)密切相關(guān)。Ca2＋是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種生物調(diào)節(jié)過(guò)程中的第二信使（如收縮、分泌、突觸傳遞、核孔調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄等）。Ca2＋是參與神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)鍵化學(xué)物質(zhì)，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞間信號(hào)釋放的關(guān)鍵化學(xué)物質(zhì)。其參與神經(jīng)元的活性和免疫系統(tǒng)，該通路的基因具有調(diào)節(jié)海馬區(qū)腦功能，能應(yīng)對(duì)壓力事件，與焦慮和抑郁及抗抑郁藥的藥效相關(guān)[11]。WANG等[12]通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的12種腫瘤的DNA甲基化狀態(tài)及其相應(yīng)的基因表達(dá)模式進(jìn)行整合分析后發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤類型的鈣信號(hào)通路均發(fā)生顯著高甲基化，且發(fā)生DNA高甲基化的基因恰好位于鈣信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，如控制胞內(nèi)鈣流量的G蛋白耦聯(lián)受體、蛋白激酶A等，認(rèn)為鈣信號(hào)通路基因的異常DNA甲基化可能作為腫瘤治療和抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。ADNAN等[13]研究發(fā)現(xiàn)，胸腺嘧啶醌與美沙酮的協(xié)同作用，涉及嗎啡成癮途徑，胸腺嘧啶醌通過(guò)嗎啡成癮通路上調(diào)磷酸二酯酶1a（PDE1A）基因、γ－氨基丁酸A型受體Theta亞基和G蛋白亞基Beta3基因的表達(dá)，認(rèn)為炎性反射的傳出通路是膽堿能突觸通路，能改善晚期哮喘炎性反應(yīng)。乙酰膽堿酯酶抑制劑介導(dǎo)外周和中樞抗炎反應(yīng)，能抑制膽堿能抗炎通路活性，減少腫瘤壞死因子－α、白細(xì)胞介素1β和白細(xì)胞介素6的水平，可能具有改善認(rèn)知的作用[14]。

進(jìn)一步通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)疾病富集分析發(fā)現(xiàn)，川貝母可治療303種疾病，包括精神類疾病，酒精依賴、自閉癥、精神分裂癥、注意缺陷障礙品行障礙對(duì)立違抗障礙、雙相情感障礙、貪食癥及抑郁癥；代謝性疾病，2型糖尿病、高膽固醇血癥、肥胖；腫瘤性疾病，非霍奇金淋巴瘤、食管腺癌及肺癌，感染性疾?。郝宰枞苑渭膊?、哮喘及感染；其他類疾病，多發(fā)性硬化及偏頭痛。通過(guò)BATMAN－TCM數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行疾病富集分析發(fā)現(xiàn)，川貝母治療疾病多集中于代謝類疾病中，能緩解疼痛類疾病。川貝母主要用于臨床治療肺系疾病，很少用于精神類疾病，本研究匯總中擴(kuò)大了川貝母的疾病治療范圍。從中醫(yī)角度來(lái)看，神志類疾病與痰飲有關(guān)（痰蒙心竅、痰氣交阻），川貝母味辛、性平，不僅能溫化肺間之痰濕，同樣能如《本草會(huì)編》所載：“治虛勞咳嗽，吐血咯血，肺痿肺癰，婦人乳癰、癰疽及諸郁之癥。”

使用String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的PPI不僅可顯示蛋白質(zhì)分子間直接的物理相互作用，還可顯示蛋白質(zhì)間的間接功能相關(guān)性。通過(guò)Cytoscape 3.5.1軟件制作PPI圖發(fā)現(xiàn)川貝母的核心化學(xué)成分，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)理論認(rèn)為，網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)直接連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多，其網(wǎng)絡(luò)的影響力就越大，度是網(wǎng)絡(luò)中與某個(gè)節(jié)點(diǎn)直接相鄰節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，因此Degree值因其衡量節(jié)點(diǎn)重要性簡(jiǎn)單、直觀的特點(diǎn)，成為度量節(jié)點(diǎn)局部中心性的重要參數(shù)。根據(jù)Degree值篩選出中心節(jié)點(diǎn)，即網(wǎng)絡(luò)中連接度較高的點(diǎn)，在網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐作用，具有關(guān)鍵的生物學(xué)功能。其中，HSP90基因（含HSP90AA1，HSP90AB1，JUN及CASP3）度值最高。

β－谷甾醇是植物甾醇類成分之一，屬四環(huán)三萜類化合物，有降膽固醇、止咳、祛痰及抑制腫瘤和修復(fù)組織的作用。VALERIO等[15]發(fā)現(xiàn)，β－谷甾醇通過(guò)增加J774A.1鼠巨噬細(xì)胞中酪氨酸磷酸酶的活性來(lái)抑制核因子(NF)－κB和STAT1等促炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性。REYES等[16]發(fā)現(xiàn)，β－谷甾醇能減弱RAW264.7細(xì)胞的內(nèi)化、細(xì)胞內(nèi)存活，并且抑制MAPKs連接的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)增強(qiáng)小鼠的感染抵抗力。而其他成分如鈉通道蛋白[17]亦能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的遷移過(guò)程、在細(xì)胞膜上的有效表達(dá)、通道降解過(guò)程及通道門(mén)控動(dòng)力學(xué)等過(guò)程影響Nav 1.5通道的功能。

因此，川貝母的活性成分為酞酸雙（2－乙基己基）酯及β－谷甾醇，主要治療靶點(diǎn)有HSP90AA1、JUN及CASP3等，可能通過(guò)影響細(xì)胞外配體門(mén)控離子通道活性、藥物結(jié)合等分子功能，突觸后膜、質(zhì)膜及細(xì)胞連接等細(xì)胞組分，藥物反應(yīng)、膽堿能突觸傳遞及腺苷酸環(huán)化酶抑制G蛋白耦聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程，對(duì)刺激神經(jīng)組織的配體－受體相互作用及（或）鈣信號(hào)通路等而起到治療作用。川貝母不僅能治療數(shù)種精神類疾病，還能治療多種代謝性疾病，通過(guò)復(fù)雜化學(xué)成分與多個(gè)靶標(biāo)，可進(jìn)一步闡釋中藥活性成分預(yù)防或治療疾病的作用。