新城疫強(qiáng)毒特異性反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

徐敏麗，于江，逯璐，張玉玉，任素芳，陳智，孫文博，郭立輝，吳家強(qiáng)，張琳

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所／山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東管理學(xué)院新興業(yè)態(tài)發(fā)展研究所，山東 濟(jì)南 250357）

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種急性、高度接觸性的禽類傳染病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的法定報(bào)告疫病，給許多國(guó)家養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［1］。NDV又稱禽副黏病毒1型，在分類上屬于單鏈負(fù)股病毒目副黏病毒科副黏病毒亞科的禽腮腺炎病毒屬，其基因組包含6個(gè)開(kāi)放閱讀框，從5′到3′依次編碼L－HN－FM－P－NP共6種結(jié)構(gòu)蛋白［2，3］，其中F蛋白是最主要的糖蛋白之一。病毒毒力的強(qiáng)弱與其裂解位點(diǎn)區(qū)的氨基酸序列相關(guān)，強(qiáng)毒株氨基酸序列一般為112R／K－R－Q－K／R－R－F117，弱毒株則為112G／E－K／R－Q－G／E－R－L117，氨基酸序列上的差異也成為在基因水平上區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒株的靶點(diǎn)。

目前，我國(guó)對(duì)于新城疫的防控主要依靠疫苗，有效的疫苗和合理的免疫程序很大程度上控制了該病的暴發(fā)和流行。但由于我國(guó)養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；B(yǎng)殖水平不一，致使NDV在養(yǎng)殖環(huán)境中長(zhǎng)期存在［4］，這也給病毒的變異進(jìn)化提供了條件，不但在宿主范圍和致病性上產(chǎn)生了變化，而且常以非典型病癥呈現(xiàn)［5－7］，所以NDV的鑒定和病例的確診必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷。當(dāng)前，NDV檢測(cè)主要使用PCR技術(shù)和血清學(xué)技術(shù)。相比于血清學(xué)技術(shù)，PCR技術(shù)在病毒的快速檢測(cè)中具有先天性優(yōu)勢(shì)，不僅耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便，而且敏感性更高。然而，由于疫苗（滅活疫苗和弱毒苗）的廣泛使用和一些天然弱毒株的存在［8］，從免疫禽類中檢測(cè)到的NDV可能是被接種的疫苗病毒或是不至于引起發(fā)病的弱毒株，即使檢測(cè)和分離到了NDV，也不能確定禽類感染了野毒。所以，準(zhǔn)確掌握NDV的感染情況，首先要排除疫苗毒的干擾，能夠快速、準(zhǔn)確區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒株或者特異性擴(kuò)增NDV強(qiáng)毒的檢測(cè)方法十分必要。

對(duì)于區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒株的PCR檢測(cè)方法已有報(bào)道，曹殿軍［9］、胡傳偉［10］、黃淑堅(jiān)［11］等設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物分別擴(kuò)增NDV強(qiáng)、弱毒株，但所建方法的靈敏度不高；岳華［8］、曹軍平［12］、王珂［13］等分別建立了基于探針?lè)ǖ尼槍?duì)NDV強(qiáng)毒的熒光定量RT－PCR方法，在檢測(cè)靈敏度方面有很大程度的提升，但探針的應(yīng)用使得檢測(cè)成本大幅提升，在廣泛應(yīng)用中受到限制。為此，急需一種低成本、高敏感性的NDV強(qiáng)毒特異性熒光定量PCR檢測(cè)方法。本研究基于熒光定量PCR高效、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，以SYBR GreenⅠ染料代替探針，配以特異性引物，建立了基于SYBR GreenⅠ嵌合熒光的NDV強(qiáng)毒特異性逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR（reverse transcription fluorescence quantitative PCR，RT－qPCR）檢測(cè)體系，能夠?yàn)樾鲁且叩谋O(jiān)測(cè)提供預(yù)警信息，從而有效控制NDV強(qiáng)毒感染的發(fā)生與蔓延。

1 材料與方法

1.1 毒株

NDV強(qiáng)毒（F48E9）、NDV弱毒（lasota、克隆30、V4）、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）、雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis，IBV）、鴨病毒性肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）、雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis，ILTV）、禽坦布蘇病毒（Avian tembusu virus，ATMUV），均由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.2 試劑

RNAiso Plus、T7 RNA Polymerase、One Step RT－PCR Kit、TB Green PremixEx Taq嵌合熒光法檢測(cè)試劑盒、Ex TaqHS，均購(gòu)自大連寶生物科技有限公司；Simply P病毒DNA／RNA提取試劑盒，杭州博日科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登錄的所有NDVF基因序列，分析強(qiáng)、弱毒區(qū)分位點(diǎn)，設(shè)計(jì)強(qiáng)毒特異性引物對(duì)，以達(dá)到只擴(kuò)增強(qiáng)毒而不擴(kuò)增弱毒的目的。上下游引物序列如下：NDV F realtime－1：5′－TACACCTCATCCCAGACAGG－3′，NDV F realtime－2：5′－AGTCGGAGGATGTTGGCAGC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為305 bp。另設(shè)計(jì)合成含T7啟動(dòng)子的上游序列，NDV F realtime－T7－1：5′－TAATACGACTCACTATAGGGTACACCTCATCCCA GACAGG－3′，用于體外轉(zhuǎn)錄模板的制備。

1.3.2 核酸提取和體外轉(zhuǎn)錄模板的制備 提取NDV、AIV、ARV、IBV、DHAV、ILTV和ATMUV的核酸，保存于－80℃?zhèn)溆谩Ｒ訤48E9的RNA為模板，以NDV Frealtime－T7－1、NDV Frealtime－2為引物，經(jīng)一步法RT－PCR擴(kuò)增得到的目的條帶作為體外轉(zhuǎn)錄模板。一步法RT－PCR反應(yīng)體系為：PrimeScript one step enzyme mix 2μL，2×one step buffer 25μL，NDV F realtime－T7－1引物（100 pmol／μL）1μL，NDV F realtime－2引物（100 pmol／μL）1μL，RNA模板2μL，RNase Free Water補(bǔ)足50μL。一步法RT－PCR反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95℃預(yù)變性2 min；94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.3.3 NDV強(qiáng)毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備 取1μL體外轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，操作按T7 RNA Polymerase試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。產(chǎn)物最終溶解于DEPC水中，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度，通過(guò)公式將得到的RNA換算為拷貝數(shù)，并用RNase Free Water進(jìn)行10倍倍比稀釋，將稀釋的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 RT－qPCR反應(yīng)體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制RT－qPCR反應(yīng)體系并進(jìn)行引物濃度、退火溫度等條件的優(yōu)化。反應(yīng)體系（20μL）：2×One Step SYBR RT－PCR buffer 10μL，Ex TaqHS 0.4μL，Primescript RT enzyme mixⅡ0.4μL，NDV F realtime－1、NDV F realtime－2引物（10～50μmol／L）各1μL，RNase Free dH2O 5.2μL，total RNA 2μL。反應(yīng)條件：42℃反轉(zhuǎn)錄5 min；95℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，53～60℃退火10 s，72℃延伸25 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。其中引物濃度取10、20、30、40、50μmol／L共5個(gè)濃度梯度；退火溫度選擇53、55、57、58、60℃，每個(gè)反應(yīng)條件均進(jìn)行3次重復(fù)。結(jié)果根據(jù)反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和溶解曲線進(jìn)行判定。隨后根據(jù)反應(yīng)體系和條件，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，選擇1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103拷貝／μL 6個(gè)濃度梯度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行RTqPCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增后用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.3.5 RT－qPCR方法的敏感性 分別以1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷貝／μL的RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，使用優(yōu)化的RT－qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，能夠有效擴(kuò)增的最低稀釋度的拷貝數(shù)為檢測(cè)方法的檢測(cè)極值。

1.3.6 RT－qPCR方法的特異性 采用優(yōu)化的體系和條件，以NDV強(qiáng)、弱毒和其他禽類常見(jiàn)病毒（AIV、ARV、IBV、DHAV、ILTV和ATMUV）的核酸為模板進(jìn)行RT－qPCR檢測(cè)，以確定該方法的特異性。

1.3.7 RT－qPCR方法的準(zhǔn)確性 利用建立的RT－qPCR方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的NDV陽(yáng)性樣本（表1，已測(cè)定F基因全序列）進(jìn)行準(zhǔn)確性驗(yàn)證。經(jīng)RT－qPCR方法擴(kuò)增，與測(cè)序結(jié)果相比較以驗(yàn)證RT－qPCR方法的準(zhǔn)確性。

表1 NDV陽(yáng)性樣本

2 結(jié)果與分析

2.1 體外轉(zhuǎn)錄模板和RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以NDV F realtime－T7－1和NDV F realtime－2為引物，F(xiàn)48E9 RNA為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄模板的制備。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和序列測(cè)定顯示，成功獲得F48E9的目的基因片段。分光光度計(jì)測(cè)得其濃度為3.2×109拷貝／μL，對(duì)其進(jìn)行10倍系列稀釋后，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

2.2 RT－qPCR反應(yīng)體系和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

RT－qPCR反應(yīng)體系的建立需要在常規(guī)體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行條件優(yōu)化。將引物濃度和退火溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果顯示，當(dāng)引物濃度為10 μmol／L、退火溫度為55℃時(shí)體系的擴(kuò)增效率明顯優(yōu)于其他條件（圖1），且在該反應(yīng)條件下溶解曲線單一（圖2），確定為反應(yīng)體系的最優(yōu)條件。根據(jù)反應(yīng)最佳條件，分別以1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103拷貝／μL濃度梯度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行RT－qPCR反應(yīng)，獲取各自的動(dòng)力學(xué)曲線（圖3），各濃度間重復(fù)性良好，以此獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝－3.307X＋2.657（圖4）。

圖1 不同反應(yīng)條件下的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 最佳反應(yīng)條件下的溶解曲線

圖3 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增結(jié)果

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 RT－qPCR方法的敏感性

如圖5所示，RT－qPCR能檢測(cè)出的模板最低濃度為1×100拷貝／μL，且陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，表明該方法的檢測(cè)極限值為1拷貝／μL。

圖5 RT－qPCR方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 RT－qPCR方法的特異性

應(yīng)用建立的RT－qPCR方法對(duì)NDV強(qiáng)毒（F48E9）、NDV弱毒（lasota、克隆30、V4）、AIV、ARV、IBV、DHAV、ILTV和ATMUV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖6）顯示，僅NDV強(qiáng)毒（F48E9）成功被擴(kuò)增，而NDV弱毒（lasota、克隆30、V4）、AIV、ARV（Ct值＞35）、IBV、DHAV、ILTV、ATMUV則沒(méi)有被擴(kuò)增出。

圖6 RT－qPCR方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 RT－qPCR方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

利用建立的RT－qPCR方法對(duì)25份已明確毒力的病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖7）顯示，10株含強(qiáng)毒序列特征的毒株RNA均能有效擴(kuò)增，而其余毒株RNA則無(wú)法擴(kuò)增，說(shuō)明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠。

圖7 RT－qPCR方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

3 討論與結(jié)論

NDV F蛋白不僅是介導(dǎo)病毒脂蛋白囊膜與宿主細(xì)胞表面融合的主要因子，還是決定病毒毒力的主要蛋白之一。F蛋白最初是以無(wú)活性F0的形式存在，在裂解成F1和F2之后，病毒才具有感染性，而F0的裂解能力取決于裂解區(qū)的氨基酸組成，如裂解區(qū)存在的堿性氨基酸越多，其裂解活性越強(qiáng)，反之則越弱。所以存在兩對(duì)堿性氨基酸（精氨酸或賴氨酸）的病毒具有較強(qiáng)的裂解活性，其毒力也較強(qiáng)，而僅存在一對(duì)堿性氨基酸病毒的F0蛋白不易被裂解，從而降低了病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合活性，使病毒感染性降低或者無(wú)感染性［14，15］。研究表明，絕大多數(shù)的禽源NDV強(qiáng)、弱毒株均符合以上規(guī)律，所以根據(jù)F基因設(shè)計(jì)特異性引物用以區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒株也是較為普遍的方法。Nidzworski等［16］于2011年設(shè)計(jì)了一種區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒株的RT－PCR方法，但分析序列時(shí)發(fā)現(xiàn)其體系中的引物無(wú)法與后來(lái)分離的病毒特異性匹配，即病毒核酸的變異使得該檢測(cè)方法失效。本研究引物的設(shè)計(jì)是基于對(duì)所有NDVF基因序列的分析，選擇強(qiáng)毒與弱毒保守但有所區(qū)分的位點(diǎn)，能夠保證較長(zhǎng)的使用時(shí)效，結(jié)果也證實(shí)設(shè)計(jì)的引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增強(qiáng)毒RNA，而無(wú)法擴(kuò)增弱毒RNA。

在NDV強(qiáng)毒特異性RT－qPCR檢測(cè)方法建立的基礎(chǔ)上努力提高敏感性是本研究的目標(biāo)之一。一般情況下，NDV感染禽類3天后，典型癥狀才逐步顯現(xiàn)，此階段是病毒復(fù)制的對(duì)數(shù)期，更是控制病毒繁殖與擴(kuò)散的關(guān)鍵期，如能及時(shí)檢測(cè)到強(qiáng)毒株的存在并采取相應(yīng)措施，能夠更好地控制疫情的發(fā)生。所以，只有高敏感性的檢測(cè)方法才能對(duì)早期感染做出準(zhǔn)確判斷。2000年，曹殿軍等［9］設(shè)計(jì)的雞NDV強(qiáng)、弱毒株RT－PCR鑒別診斷方法的敏感性僅為500 pg；黃淑堅(jiān)等［11］設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，建立了區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒株的RTPCR方法，其敏感性為10 pg，換算成拷貝數(shù)大概為105拷貝，可見(jiàn)常規(guī)PCR的檢測(cè)靈敏度無(wú)法滿足現(xiàn)在的需求。2007年，岳華等［8］報(bào)道了基于探針?lè)ǖ腘DV中強(qiáng)毒株熒光定量PCR檢測(cè)方法，敏感性為60拷貝／μL，較之前有了極大的改善；2012年，檢測(cè)體系的靈敏度達(dá)到了3拷貝／μL［12］。本研究所建立的NDV強(qiáng)毒特異性RT－qPCR檢測(cè)方法的敏感性達(dá)到1拷貝／μL，能夠更好地服務(wù)于NDV強(qiáng)毒的監(jiān)測(cè)預(yù)警。

我國(guó)禽類養(yǎng)殖的基數(shù)大，且存欄量逐年上升，對(duì)于NDV強(qiáng)毒流行情況的大規(guī)模檢測(cè)，控制成本是重要的環(huán)節(jié)。本研究使用SYBR GreenⅠ嵌合熒光顯色技術(shù)，檢測(cè)成本更低，更適合基層及大規(guī)模檢測(cè)使用。在低成本下實(shí)現(xiàn)高敏感性是檢測(cè)方法最終的追求，本研究建立的NDV強(qiáng)毒特異性RT－qPCR檢測(cè)方法敏感性高、特異性強(qiáng)且成本較低，是NDV強(qiáng)毒監(jiān)測(cè)更為合適的方法和工具。