pH和鹽度對黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪的影響

徐大德 羅斯特 李麗娟

摘要 在正常鹽度不同pH、正常pH不同鹽度和相同水溫23.2～25.7 ℃的條件下，研究pH和鹽度對黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH為7.6～8.0時(shí)，鹽度在4.0～7.0 g/L范圍內(nèi)對變態(tài)期蝌蚪96 h內(nèi)存活率無明顯影響（均在80%以上），鹽度對變態(tài)期蝌蚪的24、48、72、96 h TLm值分別為8.99、8.25、7.99和7.64 g/L，安全濃度為2.17 g/L 。在不同pH試驗(yàn)條件下，黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪適宜生存的pH為3.6～10.4，pH對變態(tài)期蝌蚪24、48、72、96 h TLm值分別為10.90、10.76、10.57和10.50，最低耐受限為3.21，最高耐受限為 12.67。

關(guān)鍵詞 黑眶蟾蜍;變態(tài)期蝌蚪;鹽度;pH

中圖分類號 S917 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2021）17-0092-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.025

Abstract The effects of pH and salinity on tadpoles of Bufo melanostictus Schneider during metamorphosis stage were carried out under the conditions of normal salinity with different pH values， normal pH values with different salinities and the same water temperature of 23.2-25.7 ℃. The results showed that when the pH value was 7.6-8.0， the salinity in the range of 4.0-7.0 g/L had no significant effect on the survival rate of tadpoles in the metamorphosis stage （all reached more than 80%）.TLm values of 24， 48， 72， 96 h were 8.99， 8.25， 7.99， 7.64 g/L， respectively， and the safe concentration was 2.17 g/L. Under different pH experimental conditions， the suitable pH range for tadpoles in metamorphosis stage was 3.6-10.4 and TLm value of pH value were 10.90， 10.76， 10.57 and 10.50， respectively. The minimum resistance limit was 3.21， the highest resistance limit was 12.67.

Key words Bufo melanostictus Schneider;Tadpoles in metamorphosis stage;Salinity;pH

黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）隸屬兩棲綱（Amphibia）無尾目（Anura）蟾蜍科（Bufonidae）蟾蜍屬（Bufo）[1]。黑眶蟾蜍個體較大，能在不同環(huán)境下生存，是我國南方常見的一種無尾兩棲動物。它既能捕食害蟲，其蟾酥在中藥里有很高的藥用價(jià)值。當(dāng)前，國內(nèi)每年能采購的蟾酥量僅能滿足需求的50%，故在國內(nèi)發(fā)展蟾蜍的人工育種具有較大的潛力[1]。目前，關(guān)于水環(huán)境因子對黑眶蟾蜍蝌蚪的影響報(bào)道主要集中在環(huán)境污染后的水中化學(xué)物質(zhì)（如金屬離子、洗滌劑、殺蟲劑[2-5]等）對其生長發(fā)育的研究，而有關(guān)鹽度和pH對其變態(tài)期蝌蚪的影響研究報(bào)道較少。筆者研究了pH和鹽度對肇慶地區(qū)黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪的影響，以期對黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪生態(tài)學(xué)資料進(jìn)行補(bǔ)充和完善。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料黑眶蟾蜍蝌蚪為長出前后四腿且尾巴還未退化的變態(tài)期蝌蚪，2019 年 4 月初取自肇慶學(xué)院生物園水池，使用pH計(jì)測定變態(tài)期蝌蚪原生長環(huán)境的pH（9.00～9.17），蝌蚪無傷病，體質(zhì)健康，體長（18.1±4.7）mm，體重（313.4±85.3）mg。試驗(yàn)前，先將蝌蚪放入已備好裝有原池水的塑料箱中暫養(yǎng)2 d，試驗(yàn)專用容器為350 mL的塑料盒，試驗(yàn)用水為澄清池沼水，pH為7.6，試驗(yàn)期間水溫為23.7～24.3 ℃，室溫為24.2～24.7 ℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pH單因素急性毒性試驗(yàn)。pH單因素急性毒性試驗(yàn)分為預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)。根據(jù)算術(shù)序列[6]的方法進(jìn)行了初步試驗(yàn)，并在3.0和12.0之間設(shè)置了20個梯度組，公差為0.5，每組隨機(jī)投入10尾變態(tài)期蝌蚪。 預(yù)試驗(yàn)中，pH 3.0組的變態(tài)期蝌蚪在放入水中2 h內(nèi)全部死亡，而pH 12.0的變態(tài)期蝌蚪在10 min內(nèi)全部死亡，pH 11.5的變態(tài)期蝌蚪在12 h內(nèi)全部死亡，而pH 11.0的變態(tài)期蝌蚪在24 h內(nèi)也全部死亡。變態(tài)期蝌蚪在pH 6.5～9.0時(shí)可存活96 h。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)各組死亡情況可知，變態(tài)期蝌蚪在pH<3、pH>11的環(huán)境中無法長時(shí)間存活，從而確定了正式試驗(yàn)pH梯度組為12組，分別為3.1、3.3、3.5、3.7、3.9、9.9、10.1、10.3、10.5、10.7、10.9和11.1，并設(shè)置1個對照組（蝌蚪飼養(yǎng)池水），pH 為7.6，每個梯度再設(shè)1次重復(fù)，每組隨機(jī)投入15尾變態(tài)期蝌蚪，其結(jié)果取平均值。為了防止水質(zhì)pH的變化，試驗(yàn)期間每12 h用已準(zhǔn)備好的澄清池沼水更換1/3水，并用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH來調(diào)節(jié)pH，使用PHS-3C pH計(jì)檢測pH。試驗(yàn)期間不投餌，隨機(jī)觀察、記錄變態(tài)期蝌蚪的狀況表現(xiàn)，記錄各組具體死亡時(shí)間，清除死亡個體，每24 h統(tǒng)計(jì)死亡尾數(shù)（蝌蚪死亡標(biāo)準(zhǔn)為身體翻身沉入水底，喪失游泳能力，對外界刺激（如針刺）無反應(yīng)）。采用“算術(shù)比例法”[7]計(jì)算出變態(tài)期蝌蚪24、48、72、96 h 平均耐受限（TLm），即半致死值（LC50）、全致死值（LC100）、零致死值（LC0）。

1.2.2 鹽度單因素急性毒性試驗(yàn)。按幾何級數(shù)間距[6]，以水中氯化鈉含量作為鹽度指標(biāo)（氯化鈉為市售食用精鹽），設(shè)置8個預(yù)備試驗(yàn)組，鹽度分別為25.629、17.086、11.390、7.593、5.063、3.375、2.250和1.500 g/L，每組隨機(jī)投入10尾變態(tài)期蝌蚪。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪在鹽度分別為25.629和17.086 g/L的條件下，4 h內(nèi)全部死亡;當(dāng)鹽度在5.063 g/L以下時(shí)，96 h內(nèi)變態(tài)期蝌蚪全部存活。鹽度為25.629 g/L的試驗(yàn)組中，變態(tài)期蝌蚪放入水中18 min時(shí)開始出現(xiàn)死亡，30 min時(shí)全部死亡;鹽度17.086 g/L的試驗(yàn)組在2 h30 min時(shí)出現(xiàn)死亡，4 h 12 min全部死亡;鹽度11.390 g/L的試驗(yàn)組變態(tài)期蝌蚪在放入水中12 h后出現(xiàn)4尾死亡，24 h內(nèi)全部死亡;鹽度7.593 g/L的試驗(yàn)組在90 h11 min出現(xiàn)第1尾蝌蚪死亡。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在鹽度4.0～12.0 g/L設(shè)置9個濃度梯度和1個對照組，每個梯度組再設(shè)置1次重復(fù)，每組隨機(jī)投放15尾變態(tài)期蝌蚪。整個試驗(yàn)期間各組均保持在與蝌蚪池相同pH（7.6～8.0）的水環(huán)境中，試驗(yàn)期間不換水、不投餌，觀察、記錄并計(jì)算半致死值（LC50）、全致死值（LC100）、零致死值（LC0），安全濃度（SC）的計(jì)算公式為 SC=48 h LC50×0.3/（24 h LC50/48 h LC50）2 [8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪的影響

由表1可知，黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪在pH為3.1～3.9時(shí)，死亡率先隨著pH的升高而下降，在pH 9.9～11.1時(shí)死亡率又隨著pH的繼續(xù)升高而增加，在pH 3.5～10.5時(shí)變態(tài)期蝌蚪至少可存活96 h;在pH 3.9～10.3時(shí)，變態(tài)期蝌蚪可以毫無影響地存活96 h（存活率均為100%），試驗(yàn)期間在塑料碗中一直保持著活躍狀態(tài);同時(shí)，黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪對0.2的pH變化幅度較為敏感。pH 3.1的試驗(yàn)組變態(tài)期蝌蚪放入1 h 30 min開始出現(xiàn)死亡，死亡時(shí)腹部皮膚呈白色，腿部及尾巴呈灰白色，且肚皮已破，露出腸子，仰面沉于水底。pH 10.9的試驗(yàn)組變態(tài)期蝌蚪放入2 h開始出現(xiàn)死亡，pH 10.7的試驗(yàn)組變態(tài)期蝌蚪在96 h內(nèi)全部死亡，且死亡個體尾部纏繞在一塊，個體尾巴彎曲或斷為兩段，這是酸堿中毒的表現(xiàn)。中毒表現(xiàn)為身體側(cè)翻，或仰面沉于水底，活動能力很弱，但用鑷子碰它時(shí)會顫動，尾部搖動，但擺動幅度不大，接近死亡。蝌蚪從出現(xiàn)中毒現(xiàn)象到真正死亡需要1～2 h。由表1可知，蟾蜍變態(tài)期蝌蚪對pH的適應(yīng)性有酸性適應(yīng)范圍和堿性適應(yīng)范圍，用“算術(shù)比例法”[7]得出酸性適應(yīng)范圍24、48、72、96 h的平均耐受限（TLm）逐漸升高，而堿性適應(yīng)范圍24、48、72、96 h的平均耐受限（TLm）逐漸降低。

2.2 鹽度對黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪的影響

該試驗(yàn)測定了不同鹽度下黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪的死亡率、致死值和安全值（表2）。采用“算術(shù)比例法”[7]得出24、48、72、96 h的TLm值分別為8.99、8.25、7.99和7.64 g/L，安全濃度為2.17 g/L，黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪對鹽度的最高耐受限（24 h LC100）為10.42 g/L，適應(yīng)鹽度上限（24 h LC0）為7.39 g/L。試驗(yàn)期間，除4.0～8.0 g/L的鹽度組和對照組外，其余組各變態(tài)期蝌蚪的死亡率均為100%;當(dāng)鹽度為4.0～7.0 g/L時(shí)，對96 h死亡率無明顯影響（死亡率均低于或等于20%），而且變態(tài)期蝌蚪較為活躍，常在水面游動。其他各鹽度組隨著鹽度的升高，變態(tài)期蝌蚪的死亡速度加快，死亡率增加。同一組24～96 h變態(tài)期蝌蚪的鹽度致死值逐漸降低。鹽度分別為10、11、12 g/L的高鹽度組，變態(tài)期蝌蚪放入后就會不斷有長條狀糞便排出，并出現(xiàn)狂游、亂竄現(xiàn)象，數(shù)小時(shí)后發(fā)現(xiàn)變態(tài)期蝌蚪反應(yīng)變得遲鈍，游動緩慢，逐漸失去平衡，最后死亡。

3 討論

3.1 pH對蟾蜍變態(tài)期蝌蚪的影響

從不同pH對蟾蜍變態(tài)期蝌蚪的影響試驗(yàn)結(jié)果來看，酸性范圍24 h LC100值和堿性范圍72 h LC100值分別為最低耐受限和最高耐受限（pH為3.21和12.67），酸性范圍96 h LC0值與堿性范圍96 h LC0值區(qū)間為蟾蜍變態(tài)期蝌蚪適宜生存的范圍（pH 3.70～10.32），與前人研究報(bào)道中國林蛙（Rana chensinensis）蝌蚪適宜生存的pH為4.3～9.7相比[8]，黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪比中國林蛙蝌蚪有更廣的pH的適應(yīng)能力范圍，對酸、堿的耐受能力更強(qiáng)，故也同樣適合生存于漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的pH范圍（6.5～8.5）內(nèi)。從pH對鰱魚魚苗、中國林蛙蝌蚪的24、48和96 h LC50值來看，蟾蜍變態(tài)期蝌蚪對pH的適應(yīng)能力略高于一般淡水魚類及中國林蛙蝌蚪，這可能與它們的生活環(huán)境有關(guān)。淡水魚類只生活在淡水環(huán)境中，其生活范圍有一定的局限性，中國林蛙蝌蚪生活在上述穩(wěn)定的水體環(huán)境中，而蟾蜍在田間、池塘、水溝、山間等潮濕地帶均有分布，屬廣布種，這些水體pH波動較大，它可能長期受到環(huán)境馴化，從而導(dǎo)致對水體pH的適應(yīng)范圍更廣，適應(yīng)能力更強(qiáng)。因此，在人工養(yǎng)殖蝌蚪中的調(diào)節(jié)pH或預(yù)防和治療某些病害過程中可將pH范圍擴(kuò)展得更廣，但控制在6.5～9.0內(nèi)較好。

3.2 鹽度對蟾蜍變態(tài)期蝌蚪的影響

蟾蜍變態(tài)期蝌蚪適合生活在有適當(dāng)鹽度的水環(huán)境中，不同鹽度的水具有不同的滲透壓，水鹽度變化可以改變蝌蚪與環(huán)境的滲透關(guān)系，達(dá)到極限時(shí)可引起生命過程的破壞，嚴(yán)重時(shí)會引起死亡，這與淡水魚類是相似的[9]。同一濃度組24～96 h蝌蚪的鹽度致死值逐漸降低，這也說明蝌蚪在適當(dāng)高的鹽度水體中經(jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng)，其適應(yīng)能力明顯提高。

在與該試驗(yàn)條件基本相同的情況下，一些淡水魚、蝦類[如麥穗魚、鯽、中國對蝦（幼蝦）、草魚、鰱、鰱/鳙（魚苗）]的24、48、72、96 h LC50值和SC值[10-16]如表3所示，而蟾蜍變態(tài)期蝌蚪對鹽度的24、48、72、96 h LC50分別為8.99、8.25、7.99和7.64 g/L，安全濃度為2.17 g/L，在鹽濃度為4.0～7.0 g/L時(shí)對蝌蚪96 h內(nèi)存活率無明顯影響（均在80%以上），結(jié)果表明蟾蜍變態(tài)期蝌蚪對鹽度具有一定的適應(yīng)能力，而其對鹽度的24、48、72、96 h LC50值比一些淡水魚類、蝦類[6，10-14，17-19]低得多。這表明蟾蜍變態(tài)期蝌蚪對鹽度的適應(yīng)性比淡水生物弱，安全濃度較低，是一種狹鹽性和低耐鹽的生物。

中國林蛙蝌蚪對鹽度的24、48、72、96 h LC50值分別為8.79、7.12、5.64和3.83 g/L，SC值為1.73 g/L，鹽度在2.0～3.0 g/L時(shí)對蝌蚪96 h存活率沒有明顯影響[16]，黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪的24、48、72、96 h LC50值及安全濃度均高于林蛙蝌蚪，故黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪對鹽度的適應(yīng)能力略高于中國林蛙蝌蚪，這可能與黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪生長環(huán)境有關(guān)，中國林蛙是分布在東北長白山區(qū)的特有種，蝌蚪階段長期生活在山泉溪流中，屬于缺鹽水體（≤0.2 g/L）[16]，其穩(wěn)定的生活環(huán)境導(dǎo)致它對水體鹽度有較嚴(yán)格的要求，具有局限性;蟾蜍在我國主要分布在廣東、廣西、福建等12?。▍^(qū)），其棲息范圍廣，在山地、平原潮濕地帶、水田、池塘、水溝、村落均有分布[20]，可能不同地區(qū)的水環(huán)境擴(kuò)增了變態(tài)期蝌蚪對鹽度的適應(yīng)性范圍，因而導(dǎo)致了變態(tài)期蝌蚪對鹽度的適應(yīng)性更強(qiáng)。

在人工養(yǎng)殖黑眶蟾蜍變態(tài)期蝌蚪時(shí)水體的鹽濃度應(yīng)不高于5.06 g/L（應(yīng)低于96 hLC0值、高于SC值）。

該研究主要進(jìn)行鹽度和pH的單因素急性毒性試驗(yàn)，其交互作用對適應(yīng)性的影響有待進(jìn)一步研究。

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