安徽省克氏原螯蝦白斑綜合征病毒和蝦虹彩病毒檢測及分析

陳紅蓮 王永杰 鮑俊杰 張靜 孫雯

摘要 2020年檢測安徽省滁州、安慶和合肥的20個稻田養(yǎng)殖的200只克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）鰓組織中白斑綜合征病毒和蝦虹彩病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白斑綜合征病毒陽性檢出率為97.5%，病毒含量達106拷貝/mg的檢出率與克氏原螯蝦死亡率呈正相關(guān)。蝦虹彩病毒陽性檢出率為13%，只在滁州的3個和合肥的2個稻田的養(yǎng)殖蝦中檢出。

關(guān)鍵詞 克氏原螯蝦;白斑綜合征病毒;蝦虹彩病毒

中圖分類號 S945.4 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）17-0085-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.023

Abstract Detection of white spot syndrome virus and shrimp hemocyte iridescent virus was performed in 200 red swamp crayfish （Procambarus clarkii） from 20 paddy fields in Chuzhou，Anqing，Hefei of Anhui Province in 2018.The results showed that the positive rate of WSSV in gill tissue of crayfish was 97.5%.The detection rate of 106 WSSV copies /mg gill tissue was positively correlated with the mortality rate of crayfish.The positive rate of shrimp hemocyte iridescent virus in crayfish was 13%，and was only detected positively in crayfish from 3 paddy fields in Chuzhou and 2 paddy fields in Hefei.

Key words Procambarus clarkii;White spot syndrome virus;Shrimp hemocyte iridescent virus

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）肉質(zhì)細(xì)嫩，深受消費者喜愛，是一種十分重要的甲殼類經(jīng)濟動物[1]。近10年來，克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，在我國水產(chǎn)行業(yè)占有重要的經(jīng)濟地位。2018年克氏原螯蝦產(chǎn)量比2017年產(chǎn)量翻倍，達164萬t[2]。2018、2019、2020年安徽省克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積分別為10.67萬、20.93萬和27.20萬hm2，呈急劇增加態(tài)勢。因此，該蝦疾病的防控對產(chǎn)業(yè)發(fā)展起舉足輕重的作用。

2006年，白斑綜合征首次在浙江舟山養(yǎng)殖克氏原螯蝦中暴發(fā)[3]。近些年，WSSV在全國各地克氏原螯蝦中檢出[2]，患病蝦死亡率高達52%[4]，給該蝦的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。2014年蝦淋巴細(xì)胞虹彩病毒（shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV）首次被報道引起浙江省凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）出現(xiàn)暴發(fā)性疾病，引起蝦大量死亡[5]。目前，病毒性疾病尚無有效治療藥物，疫情一旦暴發(fā)，不可控制。筆者在安徽省滁州市、安慶市、合肥市稻田采集克氏原螯蝦進行WSSV和SHIV檢測，對蝦的產(chǎn)量及死亡情況進行跟蹤調(diào)查，以期為稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦防控這2種病毒性疾病提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 克氏原螯蝦樣本采集

2020年5月下旬至6月初在安徽省合肥市、安慶市和滁州市20個稻田采集養(yǎng)殖的克氏原螯蝦進行檢測，每個稻田采集10只蝦，體重15～20 g?；铙w帶回實驗室，及時采集蝦的鰓組織，1只蝦為1個樣本，放置-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 WSSV熒光定量PCR檢測

取適量克氏原螯蝦鰓組織進行研磨，用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit提取DNA作為PCR擴增模板。對抽提的DNA采用OIE的WSSV熒光定量PCR方法進行擴增[6]。制備含擴增片段的質(zhì)粒，用WSSV熒光定量PCR方法擴增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行定量分析。

1.3 SHIV PCR檢測

采用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在SHIV監(jiān)測計劃中推薦的套式PCR方法進行檢測。PCR為50 μL反應(yīng)體系：DEPC水33.5 μL，10×PCR緩沖液5.0 μL（含1.5 mmol/L MgCl2），4×dNTP混合物4.0 μL（2.5 μmol/L），引物各1.0 μL（20 μmol/L），Taq DNA聚合酶0.5 μL（5.0×106 U/L），模板DNA 5.0 μL。PCR使用的引物與反應(yīng)條件見表1。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.4 克氏原螯蝦發(fā)病情況

稻田均為稻蝦連作種養(yǎng)模式，一年養(yǎng)殖一茬克氏原螯蝦，4—5月輪捕蝦上市，6月初開始種植水稻。統(tǒng)計蝦的產(chǎn)量，觀察蝦的發(fā)病情況，統(tǒng)計蝦的死亡量，計算死亡率。

1.5 WSSV感染試驗

取0.1 g患病克氏原螯蝦鰓組織，用5 mL三羥甲基氨基甲烷氯化鈉EDTA緩沖劑（0.05 mol/L Tris，0.1 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA，pH 7.4）勻漿，4 ℃、 6 000 r/min離心20 min，上清用0.45 μm PVDF膜過濾，稀釋103倍，第二腹節(jié)注射克氏原螯蝦20只，10 μL/只稀釋液，觀察蝦的死亡情況。取10只瀕臨死亡克氏原螯蝦鰓組織進行研磨，抽提蝦鰓組織的DNA采用OIE的WSSV實時熒光定量PCR方法進行擴增，進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 克氏原螯蝦WSSV檢測

200只克氏原螯蝦的WSSV熒光定量PCR檢測陽性率為97.5%，其中，15個稻田的蝦WSSV PCR陽性檢出率為100%（表2）。統(tǒng)計各稻田蝦鰓中WSSV含量為106拷貝/mg以上的檢出率：8和18號稻田的檢出率分別為100%、90%;9和15號稻田的檢出率分別為60%、30%;4、6、10和13號稻田的檢出率為20%～40%;1、2、5、7和12號稻田的檢出率均為10%。另7個稻田養(yǎng)殖蝦鰓中WSSV含量均在104拷貝/mg及以下。

2.2 克氏原螯蝦SHIV檢測 200個克氏原螯蝦鰓組織樣本，首輪SHIV PCR檢測結(jié)果均為陰性，第二輪PCR陽性檢出率為13%（表3）。滁州2、3和4號稻田養(yǎng)殖蝦的SHIV陽性檢出率分別為70%、20%、70%;合肥的19、20號稻田養(yǎng)殖蝦的SHIV陽性檢出率均為50%;安慶的7個稻田養(yǎng)殖蝦的SHIV檢測結(jié)果均為陰性。

2.3 克氏原螯蝦發(fā)病情況

20個稻田克氏原螯蝦產(chǎn)量均在2 550 kg/hm2以下。所有稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦均出現(xiàn)不同程度死亡，8和18號稻田的蝦死亡率最高，達30%;9和15號稻田的蝦死亡率分別達20%、15%;4、6、10和13號稻田的蝦死亡率均為10%。1、2、5、7和12號稻田的蝦死亡率為5%，其他7個稻田的蝦死亡率為2%。

2.4 WSSV感染試驗 人工感染試驗結(jié)果顯示，克氏原螯蝦在注射感染后5 d內(nèi)全部死亡。10只克氏原螯蝦鰓中WSSV含量為2.23×108～6.39×108拷貝/mg（圖1）。

3 討論

SHIV只在滁州和合肥的部分稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦中檢出，且首輪PCR陽性率為零，表明SHIV尚未在安徽省養(yǎng)殖克氏原螯蝦中大規(guī)模流行，且病毒攜帶量比較低，不會造成該蝦死亡。該研究使用OIE的熒光定量PCR方法檢測WSSV，比WSSV套式PCR檢測方法的靈敏度（20個拷貝）高，為4個拷貝[6]。WSSV在20個稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦中呈高流行趨勢，7個稻田養(yǎng)殖蝦的鰓中WSSV拷貝數(shù)均在104拷貝/mg以下，蝦只出現(xiàn)零星死亡。隨著稻田養(yǎng)殖蝦的鰓中WSSV含量在106拷貝/mg以上的檢出率增加，蝦死亡率也增加?？耸显r的死亡率始終低于WSSV含量為106拷貝/mg的檢出率，一個原因是克氏原螯蝦繁殖不同步，成蝦養(yǎng)成的時間不同，采取輪捕的方式上市，4月中旬之前，水溫較低，WSSV復(fù)制速度慢，蝦攜帶病毒含量低，此前出售的蝦未發(fā)病;4月下旬后水溫上升，WSSV復(fù)制加快，克氏原螯蝦攜帶WSSV的量大幅度增加。另一個原因是攜帶大量WSSV也未必導(dǎo)致敏感宿主發(fā)病、死亡[7]，人工感染試驗中瀕臨死亡的克氏原螯蝦鰓組織中WSSV含量達108拷貝/mg，表明采集的克氏原螯蝦鰓中WSSV含量均未達到導(dǎo)致其死亡的程度。維氏氣單孢菌和WSSV共同感染鰓導(dǎo)致克氏原螯蝦死亡率達100%，比單獨WSSV感染的死亡率（83.3%）高[8]。肝胰腺中氣單孢菌屬和檸檬酸桿菌屬細(xì)菌大量增殖導(dǎo)致克氏原螯蝦患病[9-11]。健康克氏原螯蝦的腸道存在一定量的氣單孢菌屬、檸檬酸桿菌屬和志賀氏菌屬條件致病菌[12]，由于細(xì)菌間的協(xié)同作用，正常情況下不會對機體健康造成危

害[13]。但WSSV感染會破壞甲殼動物中腸表皮完整性[14]，腸道中存在的條件致病菌最容易在該處定殖、繁殖，造成以條件致病菌大量增加為特點的腸道菌群失調(diào)。因此，攜帶WSSV 106拷貝/mg以上的克氏原螯蝦是否發(fā)病死亡，還取決于其機體免疫力及腸道、肝胰腺和鰓組織中條件致病菌的增殖。

2018年WSSV在全國13個省養(yǎng)殖的克氏原螯蝦中檢出率為46.3%，呈廣泛流行趨勢[2]。但白斑綜合征疾病只是零星發(fā)生，表明該病可控，主要從調(diào)控養(yǎng)殖水環(huán)境、增強克氏原螯蝦免疫和調(diào)控蝦腸道菌群入手。每隔10 d用一次分解底改，晴天施用芽孢桿菌制劑，陰雨天施用過碳酸鈉制劑，可以將稻田的環(huán)境因子（pH、氨氮、亞硝酸鹽）控制在合理范圍內(nèi)。稻田每隔10 d用碘制劑消毒一次，消滅養(yǎng)殖水體中的致病菌。用乳酸菌拌料投喂調(diào)節(jié)蝦腸道菌群。

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