3D打印制備生物材料耳廓支架的溶血反應(yīng)對(duì)比研究

吳迪 韓星 鐘自玲 鄭少川 瞿申紅

摘要：目的：討論并分析3D打印聚己內(nèi)酯（polycaprolactone ，PCL）和聚醚醚酮（Polyetheretherketone，PEEK）耳廓支架的溶血率，對(duì)比評(píng)價(jià)兩種生物材料的溶血性能。方法：通過(guò)3D建模設(shè)計(jì)聚己內(nèi)酯和聚醚醚酮的支架數(shù)據(jù)，利用熔融沉積法（FDM）打印出制備浸提液所需的材料支架，分別測(cè)定了聚己內(nèi)酯和聚醚醚酮的細(xì)胞溶血率。溶血實(shí)驗(yàn)：將浸提液、生理鹽水、蒸餾水分別加入兔抗凝血，測(cè)定溶血率。結(jié)果：聚己內(nèi)酯和聚醚醚酮材料支架溶血率的平均值分別為2.51%和4.32%，說(shuō)明聚己內(nèi)酯材料和聚醚醚酮材料均無(wú)明顯溶血反應(yīng)（低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（5%）），而聚己內(nèi)酯的溶血率小于聚醚醚酮的溶血率 ， 對(duì)比兩種材料結(jié)果可知PCL與PEEK在溶血率的比較上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-15.034，P<0.05），表明聚已內(nèi)酯相比聚醚醚酮具有更好的生物相容性。

關(guān)鍵詞：聚己內(nèi)酯;聚醚醚酮;溶血反應(yīng);耳廓畸形;3D打印耳廓支架

Abstract：Objective： To discuss and analyze the hemolysis rate of 3D printed PCL （polycaprolactone）and PEEK（Polyetheretherketone） auricle stents， and to evaluate the hemolysis performance of the two biomaterials. Methods： the data of PCL and PEEK scaffolds were designed by 3D modeling， and the material scaffolds needed to prepare the extract were printed by FDM （Fused Deposition Modelling）. Hemolysis test： the extract， normal saline and distilled water were added to rabbit anticoagulant respectively to determine the hemolysis rate. Results： the average hemolysis rate of PCL and PEEK scaffolds was 2.51% and 4.32% respectively， which indicated that PCL and PEEK scaffolds had no obvious hemolysis reaction （lower than the national standard （5%）， but the hemolysis rate of PCL was lower than that of PEEK， Comparing the results of the two materials， PCL and PEEK had significant difference in hemolysis rate （t = - 15.034， P < 0.05）， indicating that PCL had better biocompatibility than PEEK.

key words： Polycaprolactone， Polyetheretherketone， hemolytic reaction， auricle deformity， 3D Printing ，auricle stent

【中圖分類號(hào)】R4 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ?【文章編號(hào)】1673-9026（2021）09-095-03

引言

耳廓由彈性軟骨支架和被覆皮膚及其附屬物組成的解剖復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，因此耳廓再造手術(shù)是重建外科中技術(shù)上極具挑戰(zhàn)性的手術(shù)之一[1]。目前耳廓再造主要以手術(shù)為主，其中異體支架植入被廣泛關(guān)注[1]。由于3D打印能利用醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)（如CT或MRI數(shù)據(jù)）定制出針對(duì)不同患者的個(gè)性化和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，同時(shí)隨著3D打印技術(shù)的不斷成熟和制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)方面的進(jìn)步，對(duì)打印材料的要求也更加苛刻[3]。其中聚己內(nèi)酯（PCL）和聚醚醚酮（PEEK）憑借著良好的生物學(xué)性能在耳廓畸形再造領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力[4， 5]。

PCL和PEEK作為一種新興起的植入材料，植入患者體內(nèi)會(huì)直接與體內(nèi)組織直接接觸，因此評(píng)價(jià)材料的生物相容性尤為重要。本實(shí)驗(yàn)成功制備了PCL和PEEK為材料的研究支架，通過(guò)測(cè)定兩種材料的溶血率來(lái)評(píng)價(jià)其體外溶血試驗(yàn)，從而對(duì)比兩種材料的生物相容性。

支架作為細(xì)胞粘附生長(zhǎng)的基本框架，為組織再生提供細(xì)胞微環(huán)境，是決定最終成敗的關(guān)鍵因素[6， 7]。理想的耳廓支架植入物的材料應(yīng)具備以下特點(diǎn)：

1）生物相容性，即支架植入后能夠與人體組織長(zhǎng)期相容共存不會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)和組織壞死、癌變等反應(yīng);[8， 9]

2）生物降解性和可吸收性，即支架植入后細(xì)胞可以生長(zhǎng)入支架內(nèi)部，最終支架降解形成理想組織;

3）良好的力學(xué)性能和可塑性，在受到外力作用下?lián)碛凶銐虻膹?qiáng)度和彈性，變形后能夠迅速?gòu)?fù)原;

4）具備適宜尺寸的疏松多孔結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞粘附與増殖，促進(jìn)組織生長(zhǎng)融合和血管網(wǎng)形成;

而本試驗(yàn)著重從細(xì)胞溶血反應(yīng)方面研究對(duì)比PCL和PEEK的生物相容性。

1 材料和方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料及儀器：

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究使用的試驗(yàn)材料PCL和PEEK理化性能如表1。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器

3D打印機(jī)及相關(guān)3D數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)軟件（INTAMSYS 快速成型系統(tǒng)，上海遠(yuǎn)鑄智能技術(shù)有限公司，中國(guó)）

1.1.3 FDM工作原理

支架模型可以通過(guò)3D掃描儀、CT和MRI成像、各種3D軟件創(chuàng)建的模型數(shù)據(jù)中導(dǎo)出并輸入打印機(jī)，打印機(jī)通過(guò)將打印材料通過(guò)進(jìn)料系統(tǒng)送入熱熔噴嘴，并在噴嘴中形成半熔融聚合物后在 XY 平面運(yùn)動(dòng)擠出在工作臺(tái)上，逐層加工最終形成三維產(chǎn)品部件。圖1a和圖1b為FDM過(guò)程。[14] [15， 16]

1.2實(shí)驗(yàn)方法

溶血試驗(yàn)檢測(cè)支架溶血反應(yīng)

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)用成熟兔2只，雄性，體重2.0～2.5kg，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2.2. 實(shí)驗(yàn)試劑

水合氯醛，0.9%生理鹽水、蒸餾水、2%草酸鉀溶液。

1.2.3試驗(yàn)材料支架制備

為了制備PEEK、PCL植入支架，利用建模軟件（3Dmax），將支架數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)為沿X軸、Y軸、Z軸的立體模型，然后將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為STL文件，通過(guò)切片軟件（IntamSuite）快速切片生成Gecode格式，用于控制FDM 3D打印機(jī)，如圖2[17， 18]。用作打印材料的PEEK和PCL長(zhǎng)絲通過(guò)進(jìn)料管進(jìn)入3D印刷機(jī)，分別在480℃（PEEK 高溫噴頭）和60℃（PCL 低溫噴頭）熔融注入噴嘴，進(jìn)行逐層打?。?.1mm），將各層融合在一起形成植入支架，整個(gè)過(guò)程在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成[11， 19]。

圖2 ?A.利用3Dmax軟件制作需要的支架模型或者利用3D掃描儀掃描實(shí)物獲取數(shù)據(jù)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)為Stl（立體光刻）格式;B.將Stl（立體光刻）格式數(shù)據(jù)導(dǎo)入切片軟件進(jìn)行水平層切片處理，使立體模型轉(zhuǎn)換成一層層的水平層，并生成能被3D打印機(jī)識(shí)別的Gecode格式文件;C.將文件導(dǎo)入至導(dǎo)入3D打印機(jī)內(nèi)，調(diào)節(jié)打印機(jī)參數(shù)，選擇PLA、PEEK打印材料，逐層打印植入支架。

1.2.4 ?用于制作浸提液支架的制備過(guò)程，如圖3

1.2.5 PEEK和PCL支架材料浸提液的制備：

首先將打印出的PCL和PEEK支架進(jìn)行滅菌處理，按浸提介質(zhì)：表面積=1ml：3cm2 加入浸提介質(zhì)0.9%生理鹽水中。放入 37℃±1℃恒溫箱中 24 小時(shí)得到支架浸提液，用0.22μm微孔濾器過(guò)濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹20]。

1.2.6操作步驟

1）用 10%水合氯醛將實(shí)驗(yàn)用兔麻醉，注射器刺入心臟采血 20mL，加入2%草酸鉀2ml制成新鮮抗凝血，按新鮮抗凝血：生理鹽水=4：5的比例制成稀釋后的兔抗凝血。

2）將實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水（陰性對(duì)照組）、蒸餾水組（陽(yáng)性對(duì)照組）和0.9%生理鹽水制備的浸提液（實(shí)驗(yàn)組）三組溶液置于 37℃水浴鍋預(yù)熱 30min，三組溶液各取 10mL 于離心管中，分別加入稀釋后的兔抗凝血 0.2mL，混勻后繼續(xù)在 37℃水浴鍋 保溫1h。

3）2500r/min，離心5min，取上清液，檢測(cè) 545 nm 處檢測(cè)各組吸光度值。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn) 3 次，并計(jì)算支架浸提液溶血率的平均值：

溶血率=（實(shí)驗(yàn)組值-陰性對(duì)照組值）/（陽(yáng)性對(duì)照組值-陰性對(duì)照組值）×100%。（公式1）

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)采用 SPSS27.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，按照上述溶血率計(jì)算公式得到三組溶血率，取均值對(duì)比兩種材料的溶血率。兩種材料之間的比較采用t檢驗(yàn)，以 P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)PEEK和PCL支架的溶血率根據(jù)公式1計(jì)算，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)下表2和表3，兩種材料支架溶血率均小于 5%，所以本實(shí)驗(yàn)兩種材料符合國(guó)家生物材料安全評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

溶血試驗(yàn)是以材料在體外接觸紅細(xì)胞時(shí)的紅細(xì)胞溶解程度和血紅蛋白解離程度作為依據(jù)。根據(jù)表2和表3溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，PCL材料支架的溶血率為2.51%，PEEK材料支架的溶血率為4.32%，得出PCL的溶血率小于PEEK的溶血率 ，由表4得出結(jié)論：對(duì)比兩種材料結(jié)果可知PCL與PEEK在溶血率的比較上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-15.034，P<0.05），表明PCL相比PEEK具有更好的生物相容性。

3討論

3 D 打印技術(shù)是以數(shù)字模型為基礎(chǔ)，將打印材料在三維層面逐層精確堆積，從而快速制造所需三維實(shí)體技術(shù)，在本研究中成功地被應(yīng)用于制備用于制作浸提液的三維支架，3D打印的優(yōu)點(diǎn)在于可以最大程度滿足個(gè)性化需求。近年來(lái)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛運(yùn)用，幾乎應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的所有子專業(yè)[21]，尤其在耳科重建領(lǐng)域有著更長(zhǎng)遠(yuǎn)的意義。耳廓再造手術(shù)是耳科疾病中極具挑戰(zhàn)性的手術(shù)之一，近年來(lái)，臨床上治療耳廓缺損再造主要是以自體肋軟骨移植手術(shù)為主，雖然被廣泛接受，但同時(shí)也具有極大的局限性，而利用生物材料進(jìn)行3D打印個(gè)性化耳廓植入支架的應(yīng)用為耳廓重建提供一種新的選擇[22]，Zhu Peng [23]等對(duì)20 例小兒畸形患者利用 3D 打印模型耳廓重建與傳統(tǒng)二維重建術(shù)后滿意度的進(jìn)行比較，得出前者取得了非常好的臨床效果。隨著3D打印技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的成熟運(yùn)用同時(shí)，醫(yī)用 3D 打印高分子材料也已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但由于臨床對(duì)材料的各種性能有著非常高的要求，材料的安全性、生物相容性是必須考慮的因素[24， 25]，良好的生物性能會(huì)使材料在植入機(jī)體后，更易于使機(jī)體受損的組織或器官得以修復(fù)或重建。在眾多的生物材料中，PCL和PEEK因具有良好的生物性能在臨床上被得到廣泛的應(yīng)用，通過(guò)制備兩種材料的浸提液進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究對(duì)比其溶血率，得出PCL相比于PEEK材料具有更低的溶血率，表明PCL具備更好的生物相容性，但是材料的選擇和利用受到多種因素的影響，單從溶血率比較篩選出某個(gè)材料更適合作為植入支架是不全面的，所以兩種植入材料在其他生物性能方面進(jìn)行進(jìn)一步研究對(duì)比，以求尋找到植入材料的不足從而避免對(duì)人體的造成不可逆的傷害。

參考文獻(xiàn)：

[1]. Balaji， S.M.， Two stage ear/microtia reconstruction using costal cartilage. Annals of Maxillofacial Surgery， 2015. 5（2）： p. 163.

[2]. Park， J.Y.， et al.， Development of a 3D cell printed structure as an alternative to autologs cartilage for auricular reconstruction. J Biomed Mater Res B Appl Biomater， 2017. 105（5）： p. 1016-1028.

[3]. Hempel， J.M.， et al.， Partial auricular reconstruction with porous polyethylene frameworks and superficial temporoparietal fascia flap. Eur Arch Otorhinolaryngol， 2014. 271（10）： p. 2761-6.

[4]. Zhao， Y.， et al.， Cytocompatibility， osseointegration， and bioactivity of three-dimensional porous ?and nanostructured network on polyetheretherketone. Biomaterials， 2013. 34（37）： p. 9264-77.

[5]. Tambralli， A.， et al.， A hybrid biomimetic scaffold composed of electrospun polycaprolactone nanofibers ?and self-assembled peptide amphiphile nanofibers. Biofabrication， 2009. 1（2）： p. 025001.

[6]. Nayyer， L.， et al.， Tissue Engineering. Plastic and Reconstructive Surgery， 2012. 129（5）： p. 1123-1137.

[7]. Do， A.， et al.， 3D Printing of Scaffolds for Tissue Regeneration Applications. Advanced Healthcare Materials， 2015. 4（12）： p. 1742-1762.

[8]. Havla， J.B.， et al.， Cartilage tissue engineering for auricular reconstruction： In vitro evaluation of potential genotoxic and cytotoxic effects of scaffold materials. Toxicology in Vitro， 2010. 24（3）： p. 849-853.

[9]. Bichara， D.A.， et al.， The Tissue-Engineered Auricle： Past， Present， and Future. Tissue Engineering Part B： Reviews， 2012. 18（1）： p. 51-61.

[10]. Gu， R.， et al.， Biocompatibility of polyetheretherketone for the treatment of orbital bone defects. International journal of ophthalmology， 2020. 13（5）： p. 725-730.

[11]. Feng， X.， et al.， Osteointegration of 3D-Printed Fully Porous Polyetheretherketone Scaffolds with Different Pore Sizes. ACS Omega， 2020. 5（41）： p. 26655-26666.

[12]. Haryńska， A.， et al.， Medical-Grade PCL Based Polyurethane System for FDM 3D Printing—Characterization and Fabrication. Materials， 2019. 12（6）： p. 887.

[13]. Chou， Y.， et al.， Development of a Three-Dimensional （3D） Printed Biodegradable Cage to Convert Morselized Corticocancellous Bone Chips into a Structured Cortical Bone Graft. International Journal of Molecular Sciences， 2016. 17（4）： p. 595.

[14]. Zopf， D.A.， et al.， Computer Aided-Designed， 3-Dimensionally Printed Porous Tissue Bioscaffolds for Craniofacial Soft Tissue Reconstruction. Otolaryngology-Head and Neck Surgery， 2015. 152（1）： p. 57-62.

[15]. Kang， H.， C. Lin and S.J. Hollister， Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity. Structural and Multidisciplinary Optimization， 2010. 42（4）： p. 633-644.

[16]. Muwaffak， Z.， et al.， Patient-specific 3D scanned and 3D printed antimicrobial polycaprolactone wound dressings. International journal of pharmaceutics， 2017. 527（1-2）： p. 161-170.

[17]. Haryńska， A.， et al.， Medical-Grade PCL Based Polyurethane System for FDM 3D Printing—Characterization and Fabrication. Materials， 2019. 12（6）： p. 887.

[18]. Haryńska， A.， et al.， Fabrication and Characterization of Flexible Medical-Grade TPU Filament for Fused Deposition Modeling 3DP Technology. Polymers， 2018. 10（12）： p. 1304.

[19]. Yao， Q.， et al.， Design， construction and mechanical testing of digital 3D anatomical data-based PCL-HA bone tissue engineering scaffold. Journal of Materials Science： Materials in Medicine， 2015. 26（1）.

[20]. Wang， L.， et al.， Cytotoxicity and Hemolytic Properties of Nano-Hydroxyapatite/Polyetheretherketone Biocomposites. Materials Science Forum， 2016. 848： p. 567-572.

[21]. Galstyan， A.， et al.， Applications of 3D printing in breast cancer management. 3D Print Med， 2021. 7（1）： p. 6.

[22]. Bos， E.J.， et al.， Developing a parametric ear model for auricular reconstruction： a new step towards patient-specific implants. J Craniomaxillofac Surg， 2015. 43（3）： p. 390-5.

[23]. Zhu， P. and S. Chen， Clinical outcomes following ear reconstruction with adjuvant 3D template model. Acta Otolaryngol， 2016. 136（12）： p. 1236-1241.

[24]. Deng， M.， et al.， Nanostructured polymeric scaffolds for orthopaedic regenerative engineering. IEEE Trans Nanobioscience， 2012. 11（1）： p. 3-14.

[25]. Muwaffak， Z.， et al.， Patient-specific 3D scanned and 3D printed antimicrobial polycaprolactone wound dressings. Int J Pharm， 2017. 527（1-2）： p. 161-170.

基金資助：2018年廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（桂科AB1850010）;2018年廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)開(kāi)發(fā)與推廣應(yīng)用項(xiàng)目（S2018039）