用電壓鉗檢測(cè)煙堿型乙酰膽堿受體導(dǎo)電孔道的重要位點(diǎn)

薛奮勤，李 華，劉麗娜，許 晴，薛 冰，魏 華

(首都醫(yī)科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室, 北京 100069)

煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)屬于配體門控離子通道中半胱氨酸環(huán)受體家族的一員，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的大腦中。其中α7 nAChR是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一個(gè)主要受體,對(duì)鈣離子有很高的通透性[1]，在興奮性突觸傳遞、遞質(zhì)釋放和神經(jīng)突生長(zhǎng)等神經(jīng)元活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[1-2]。

α7 nAChR由5個(gè)相同亞基組成,每個(gè)亞基均有一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域(N端)，4個(gè)跨膜區(qū)段(M1-M4)和1個(gè)胞內(nèi)環(huán)。每個(gè)亞基的跨膜區(qū)段M2借助于疏水作用力參與了受體導(dǎo)電孔道的形成。神經(jīng)遞質(zhì)或激動(dòng)劑與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后會(huì)誘導(dǎo)受體構(gòu)象變化，該變化傳播到跨膜區(qū)段進(jìn)而將孔道打開(kāi)[3]；但是隨著受體長(zhǎng)時(shí)間與神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)合，導(dǎo)電孔道又會(huì)關(guān)閉，即所謂的脫敏，脫敏會(huì)調(diào)控突觸的傳遞過(guò)程[4]。所以研究α7 nAChR導(dǎo)電孔道的主要控制位點(diǎn)對(duì)于解析通道的激活機(jī)理及突觸傳遞有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性非洲爪蟾(杭州爪蟾資源中心)；人α7 nAChR亞基的cDNA及卵母細(xì)胞表達(dá)的載體pGEMHE(本實(shí)驗(yàn)室保存)；基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene公司)；麻醉劑MS-222(Sigma-Aldrich公司)；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 α7 nAChR亞基結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建及跨膜區(qū)段M2的位置：以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)中電魚(yú)(torpedo)的煙堿受體(代碼為2BG9)A鏈為基準(zhǔn)，采用Discovery Studio軟件先將α7 nAChR亞基與之進(jìn)行序列比對(duì)，然后以A鏈為模板由軟件構(gòu)建α7 nAChR亞基的三維結(jié)構(gòu)模型。用Pymol軟件顯示α7 nAChR亞基的結(jié)構(gòu)模型并展示其跨膜區(qū)段M2的位置。

1.2.2 測(cè)定α7 nAChR亞基的M2各個(gè)突變體對(duì)ACh的敏感性：基于PCR的定點(diǎn)突變方法將編碼人α7 nAChR亞基M2區(qū)段的所有氨基酸(Leu248-Ala258)逐個(gè)突變成親水性氨基酸絲氨酸，然后通過(guò)cDNA質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄的方法，以表達(dá)α7 nAChR亞基M2突變體制備cRNA，再將cRNA注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞中以表達(dá)α7nAChR亞基M2突變體，注射1～3 d后，室溫下(22 ℃)用雙電極電壓鉗記錄卵母細(xì)胞膜電流。詳情參考文獻(xiàn)[5-6]。

用系列濃度的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)灌流已注射cRNA的卵母細(xì)胞，測(cè)定其膜電流值，計(jì)算受體及突變體對(duì)ACh的半效應(yīng)濃度值(median effective concentration,EC50)，通過(guò)對(duì)EC50的比較，分析各突變體對(duì)ACh的敏感性差異。

1.2.3 測(cè)定α7 nAChR亞基的M2突變體對(duì)ACh的脫敏程度: 與野生型(wild type，WT)相比,將對(duì)ACh敏感性顯著降低的突變體cRNA注射到爪蟾卵母細(xì)胞中，注射1～3 d后用飽和濃度的ACh刺激并記錄卵母細(xì)胞膜電流，對(duì)突變體的脫敏曲線進(jìn)行擬合，得到各突變體脫敏的時(shí)間常數(shù)(τ值)。

1.2.4 α7 nAChR亞基的M2突變體對(duì)ACh的敏感性與脫敏程度的相關(guān)性分析:將α7 nAChR亞基的M2突變體對(duì)ACh的EC50和脫敏τ值的1/τ取對(duì)數(shù)，對(duì)log(EC50)和log(1/τ)進(jìn)行線性回歸分析，研究突變體對(duì)ACh的敏感性和脫敏程度的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 α7 nAChR亞基結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建及跨膜區(qū)段M2的位置

α7 nAChR亞基主要由胞外結(jié)構(gòu)域(N端)、偶聯(lián)區(qū)、4個(gè)跨膜區(qū)段(M1-M4)，以及位于跨膜區(qū)段M3和M4之間的胞內(nèi)環(huán)組成(圖1)。其中跨膜區(qū)段M2借助于疏水作用力參與了受體導(dǎo)電孔道的形成。

A.structure of α7 nAChR subunit and its related domains；B.transmembrane region M2 of α7 nAChR subunit is involved in the formation of ion-conducting pore of the receptor by the hydrophobic force圖1 α7 nAChR三維結(jié)構(gòu)模型及跨膜區(qū)段M2的位置Fig 1 Location of the transmembrane segment M2 in the three-dimensional structural model of α7 nAChR

2.2 測(cè)定α7 nAChR亞基的M2各個(gè)突變體對(duì)ACh的敏感性

α7 nAChR亞基跨膜區(qū)段M2的突變體L248S、V252S、L255S和L256S對(duì)ACh的EC50值減少得最多，超過(guò)20倍(表1)。與WT相比，4個(gè)親水性突變導(dǎo)致劑量-反應(yīng)曲線向左顯著移動(dòng)(圖2)。

圖2 α7 nAChR野生型及其突變體對(duì)乙酰膽堿的劑量-反應(yīng)曲線Fig 2 Dose-response curve of wild type and its mutantsof α7 nAChR against the agonist acetylcholine

表1 用雙電極電壓鉗測(cè)定各突變體的EC50值

2.3 測(cè)定α7 nAChR亞基的M2各個(gè)突變體對(duì)ACh的脫敏程度

M2區(qū)的4個(gè)突變體(L248S、V252S、L255S和L256S)在爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)后，用飽和濃度的ACh來(lái)刺激這些突變體。結(jié)果顯示，與WT相比，4個(gè)突變體的脫敏程度均顯著降低(圖3)。

τ(WT)=0.17±0.04 s, n=6；τ(L248S)=180.00±5.28 s and τ(V252S)=300.00±12.65 s, n=4, P<0.001; τ(L255S)=8.09±0.47 s and τ(L256S)=6.98±0.71 s, n=4, P<0.01

2.4 α7 nAChR亞基的M2各個(gè)突變體對(duì)ACh敏感性與脫敏程度的相關(guān)性分析

M2區(qū)突變體對(duì)ACh敏感性和脫敏程度呈正相關(guān)性(圖4)。

圖4 α7 nAChR野生型和突變體對(duì)乙酰膽堿的敏感性與脫敏程度相關(guān)性Fig 4 Sensitivity of wild type α7 nAChR and its mutants to acetylcholine was positively correlated with the degree of desensitization(R2=0.98)

3 討論

在本研究中，采用定點(diǎn)突變和雙電極電壓鉗的方法，檢測(cè)了組成人α7 nAChR導(dǎo)電孔道的主要氨基酸位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)位于該受體M2跨膜區(qū)段的4個(gè)位點(diǎn)(L248、V252、L255和L256)進(jìn)行親水性突變后，它們對(duì)激動(dòng)劑ACh的敏感性提高， 即增加了離子通道受體的開(kāi)放概率。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)親水性突變體對(duì)ACh的脫敏程度降低，即這些離子突變體的離子通道一旦打開(kāi)便不易關(guān)閉。綜上，這些結(jié)果表明位于M2跨膜區(qū)段的L248、V252、L255和L256位點(diǎn)對(duì)于離子通道的開(kāi)放起著決定性作用，是組成α7 nAChR受體導(dǎo)電孔道的主要氨基酸位點(diǎn)。

乙酰膽堿受體包括毒蕈堿型乙酰膽堿受體和煙堿型乙酰膽堿受體，它在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要作用。其中，α7 nAChR是由5個(gè)相同亞基組成的五聚體，對(duì)鈣離子的通透性高，對(duì)鈣離子的濃度調(diào)控及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起著重要作用[7]。α7 nAChR與阿爾茨海默病、帕金森病、精神分裂癥及癲癇等發(fā)病有著十分密切的聯(lián)系[4]。

nAChR的激活過(guò)程涉及到受體的多個(gè)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)激動(dòng)劑結(jié)合到位于nAChR胞外端的結(jié)合位點(diǎn)后，該區(qū)域即發(fā)生構(gòu)象變化。隨后，這些構(gòu)象變化要通過(guò)處于胞外端和跨膜區(qū)段的耦合區(qū)段才能傳遞到導(dǎo)電孔道，從而使通道打開(kāi)。在這個(gè)過(guò)程中，多個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括胞外端、loop7、loop2、M1和M2-M3連接區(qū)段及導(dǎo)電孔道等，都參與了構(gòu)象變化的傳遞，最終使受體通道激活[8]。

目前，nAChR激活的結(jié)構(gòu)學(xué)機(jī)理還不完全清楚。盡管前人的研究表明在受體通道的激活過(guò)程中多個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生了構(gòu)象變化，但是構(gòu)象變化怎樣從胞外端傳遞到導(dǎo)電孔道還不完全清楚。其中一個(gè)基本的問(wèn)題是在構(gòu)象發(fā)生變化的結(jié)構(gòu)域中哪些氨基酸起著重要作用[9]。在本研究中，通過(guò)定點(diǎn)突變和雙電極電壓鉗的方法，發(fā)現(xiàn)位于受體M2跨膜區(qū)段的L248、V252、L256和L255是組成α7 nAChR導(dǎo)電孔道的主要氨基酸位點(diǎn)。該研究對(duì)于研究nAChR的激活及脫敏的結(jié)構(gòu)學(xué)機(jī)理起著重要的基礎(chǔ)作用。