多種超分辨熒光成像技術(shù)比較和進(jìn)展評(píng)述

陳 婕, 劉文娟, 徐兆超

(1.中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

所見(jiàn)即所得是生命科學(xué)研究的中心哲學(xué),貫穿在不斷認(rèn)識(shí)單個(gè)分子、分子復(fù)合體、分子動(dòng)態(tài)行為和整個(gè)分子網(wǎng)絡(luò)的歷程中?；畹膭?dòng)態(tài)分子才是有功能的,這決定了熒光顯微成像在生命科學(xué)研究中成為不可替代的工具。但是當(dāng)熒光成像聚焦到分子水平的時(shí)候,所見(jiàn)并不能給出想要得到的。這個(gè)障礙是由于受光學(xué)衍射極限的限制,熒光顯微鏡無(wú)法在衍射受限的空間內(nèi)分辨出目標(biāo)物。為了克服衍射極限的限制,以Stefan Hell、William E.Moerner、Eric Betzig、Xiaowei Zhuang、Mats G.L.Gustafsson為代表的科學(xué)家從20世紀(jì)90年代開(kāi)始尋求方法,最終在2008年前后使得超分辨成像技術(shù)趨于成熟[1]。Hell[2]發(fā)明了受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)(stimulated emission depletion, STED), Moerner[3]開(kāi)創(chuàng)了單分子定位技術(shù)(single-molecule localization microscopy, SMLM), Betzig等[4]提出了單分子定位成像的原理,并發(fā)明了光激活定位顯微成像技術(shù)(photoactivated localization microscopy, PALM), Zhuang等[5]發(fā)明了基于熒光小分子的隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)超分辨成像技術(shù)(stochastically optical reconstruction microscopy, STORM), Gustafsson[6]發(fā)明了結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡技術(shù)(structured illumination microscopy, SIM)。這3種技術(shù)為主要代表的超分辨熒光成像技術(shù)已在生命科學(xué)和材料科學(xué)中展示出巨大的威力和應(yīng)用前景。本文通過(guò)對(duì)這3種技術(shù)的原理比較和在生物研究中的應(yīng)用進(jìn)展介紹,期望幫助研究者明確不同超分辨成像技術(shù)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和適用的應(yīng)用方向,以方便研究者在未來(lái)研究中做合理的選擇。

1 超分辨成像原理

1.1 SIM:簡(jiǎn)單的樣品制備及中等分辨率的提高

SIM和STED技術(shù)均可歸于基于特殊強(qiáng)度分布的照明顯微成像技術(shù)一類(lèi)。SIM成像的原理如圖1a所示[7],在熒光顯微成像中,通過(guò)對(duì)系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的卷積和對(duì)樣品的熒光強(qiáng)度分布可獲得樣品的熒光圖像,相當(dāng)于對(duì)熒光強(qiáng)度的頻譜進(jìn)行了低通濾波。因而空間上相鄰的熒光分子在密集的分子群中表現(xiàn)出高的空間頻率,這些高頻分量對(duì)應(yīng)樣品的細(xì)微結(jié)構(gòu),在通過(guò)物鏡被低通濾波截?cái)嗪蟛荒鼙粰z測(cè)器接收,因而傳統(tǒng)熒光成像時(shí)丟失了大量樣品精細(xì)結(jié)構(gòu)的信息,如何收集這些高頻信息成為突破衍射極限的關(guān)鍵。為了達(dá)到這個(gè)目的,SIM技術(shù)利用了莫爾效應(yīng),莫爾效應(yīng)是通過(guò)用結(jié)構(gòu)化光照射樣品而產(chǎn)生的,當(dāng)兩個(gè)周期性圖案重疊時(shí),會(huì)出現(xiàn)稱(chēng)為莫爾條紋的較粗的圖案,該空間頻率恰好偏移了結(jié)構(gòu)化模式的頻率。在莫爾效應(yīng)的影響下,SIM將傳統(tǒng)熒光顯微鏡丟失的高頻信息移入到可被檢測(cè)的低頻區(qū)域,而后通過(guò)進(jìn)一步的算法優(yōu)化和處理將其中的高頻信息進(jìn)行恢復(fù),從而提高了成像的分辨率[8]。值得注意的是,SIM在焦平面上的分辨率約為傳統(tǒng)熒光顯微鏡的2倍,即約為100 nm[9]。這是由于SIM的照明模式是由兩束激發(fā)光經(jīng)過(guò)物鏡后在樣品面上干涉產(chǎn)生,因此周期性的條紋也是衍射受限的。

圖1 主要超分辨率技術(shù)原理

近些年SIM也出現(xiàn)了一些重要的改進(jìn)技術(shù),Gustafsson等[6]在2005年基于熒光團(tuán)在強(qiáng)激光下的非線性效應(yīng)提出了飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(saturated structured illumination microscopy, SSIM),這一技術(shù)將傳統(tǒng)SIM的橫向分辨率提升到了約40 nm。但是這種成像技術(shù)也存在一定的缺點(diǎn),SSIM的激發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)且激發(fā)功率較高,因此這種方法在應(yīng)用于活細(xì)胞成像時(shí)受到了很大的局限。Sonnen等[10]在2008年開(kāi)發(fā)了3D-SIM技術(shù),將橫向分辨率及縱向分辨率分別提升至約100 nm和約300 nm。但目前SIM作為一種基于寬場(chǎng)的超分辨顯微成像技術(shù)仍存在一些問(wèn)題。首先,基于寬場(chǎng)照明的激發(fā)模式的能量密度較低,因此在成像過(guò)程中很容易受到樣品散射的影響,且其組織穿透深度較低,其應(yīng)用大多局限在單細(xì)胞層面。SIM面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn)是圖像處理速度,特別是隨著圖像采集速度的迅速提高,如何足夠快地處理這些數(shù)據(jù)變得越來(lái)越具有挑戰(zhàn)性。此外,樣品所引起的相差也是SIM在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集中或數(shù)據(jù)重構(gòu)過(guò)程中需要加以解決或加以修正的問(wèn)題[11]。

SIM具有樣品制備簡(jiǎn)單,成像速度快,成像視野大等優(yōu)勢(shì),目前已趨于成熟并已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化,在生物學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛的應(yīng)用。此外,與其他超分辨成像技術(shù)相比,SIM對(duì)于成像分辨率的提升并不依賴(lài)于特殊的熒光探針,普通的熒光團(tuán)不需要特殊的性質(zhì)就可以使用,可選擇的熒光分子多,特別適用于活細(xì)胞多色動(dòng)態(tài)成像。

1.2 STED:更高的分辨率

STED是第一種應(yīng)用于細(xì)胞成像的遠(yuǎn)場(chǎng)超分辨成像技術(shù),該技術(shù)通過(guò)純光學(xué)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光團(tuán)亮態(tài)和暗態(tài)的調(diào)控,利用受激輻射效應(yīng)來(lái)壓縮發(fā)光點(diǎn)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)從而繞過(guò)光學(xué)衍射極限限制。

熒光分子在受到激發(fā)后由基態(tài)S0態(tài)躍遷到電子激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)Sn*,而后弛豫到激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)S1態(tài)回到基態(tài)S0并發(fā)出熒光,這一過(guò)程稱(chēng)為自發(fā)輻射過(guò)程。但是如果熒光分子在激發(fā)態(tài)還未來(lái)得及向基態(tài)躍遷發(fā)射光子時(shí)系統(tǒng)內(nèi)恰有第二個(gè)光子,且其能量恰好等于熒光團(tuán)基態(tài)與激發(fā)態(tài)能級(jí)差,此時(shí)熒光團(tuán)則會(huì)吸收第二個(gè)光子并同時(shí)發(fā)射兩個(gè)與吸收的第二個(gè)光子具有相同能量、頻率、相位及傳播方向的光子,即發(fā)生受激輻射過(guò)程,自發(fā)輻射過(guò)程則被抑制[12]。STED建立在共聚焦顯微鏡基礎(chǔ)上,采用兩個(gè)激光器分別作為激發(fā)光光源和損耗光光源,其中損耗光光源產(chǎn)生的激光束通過(guò)螺旋相位板轉(zhuǎn)變?yōu)橹锌盏募す夤馐?并與激發(fā)光光源經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直疊加后照射到樣品上,二者共同作用產(chǎn)生縮小的自發(fā)輻射光斑,得到STED超分辨圖像(見(jiàn)圖1b)[7]。對(duì)于生物樣品來(lái)說(shuō),STED的橫向分辨率通常在30 nm到80 nm之間,具體取決于樣品的性質(zhì)和消耗激光的應(yīng)用功率[13]。

在STED成像中要獲得更高的分辨率就需要高效地使損耗光照射的熒光團(tuán)進(jìn)入暗態(tài),自發(fā)輻射通常在樣品被激發(fā)后幾個(gè)納秒內(nèi)發(fā)生,因此需要嚴(yán)格控制受激輻射發(fā)生的時(shí)間,通常激發(fā)光要先于損耗光約200 ps到達(dá)樣品,才可以保證熒光團(tuán)被有效激發(fā)和損耗。此外,由于時(shí)間范圍很短,且熒光分子的受激輻射橫截面很小,要想完全耗盡重疊區(qū)域的熒光就需要非常高的STED光強(qiáng)度,STED光強(qiáng)度越大,系統(tǒng)的空間分辨率也就越高。從理論上說(shuō),無(wú)限增加耗盡激光功率可以無(wú)限提高STED的分辨率。但在實(shí)際應(yīng)用中,損耗光功率過(guò)大容易導(dǎo)致細(xì)胞光毒性和熒光團(tuán)的光漂白等問(wèn)題,這是STED技術(shù)在活細(xì)胞成像中迫切需要解決的挑戰(zhàn)[11]。

理論上所有的熒光發(fā)色團(tuán)均能發(fā)生受激輻射以得到STED超分辨成像,但由于高強(qiáng)度損耗光(一般為共聚焦激發(fā)光的100倍)所造成的光漂白問(wèn)題,使STED在應(yīng)用的初期可用的染料范圍相當(dāng)有限。理想的STED染料應(yīng)具有高亮度、高光穩(wěn)定性的、大斯托克斯位移等特點(diǎn),目前報(bào)道可用于STED成像的熒光探針主要可分為3類(lèi):熒光蛋白、有機(jī)小分子染料和熒光納米顆粒。2006年Willig等[14]利用綠色熒光蛋白(GFP)實(shí)現(xiàn)了病毒和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的超分辨成像,其分辨率達(dá)到70 nm。但與有機(jī)小分子熒光染料和熒光納米顆粒相比,熒光蛋白的光穩(wěn)定性和亮度仍有較大的差距,目前依舊難以實(shí)現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的STED成像。而一些結(jié)構(gòu)優(yōu)化過(guò)的有機(jī)染料分子被證明具有良好的抗光漂白性質(zhì),如結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的硅羅丹明類(lèi)染料可以在長(zhǎng)達(dá)1 500 s的STED成像后仍保留近70%的熒光信號(hào)[15]。目前也已經(jīng)有多種商業(yè)化染料可供選擇,如ATTO系列、Abberior系列等[16]。此外,一些高亮度抗漂白的熒光納米顆粒,如量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換納米顆粒、染料復(fù)合等離子體納米顆粒等材料也正在被逐漸應(yīng)用于STED成像領(lǐng)域[17]。

1.3 SMLM:單分子定位成像

除STED和SIM技術(shù)外,SMLM技術(shù)也是一種可以克服衍射極限而獲得超分辨圖像的成像方法。SMLM是基于單個(gè)熒光團(tuán)在on態(tài)(熒光)和off態(tài)(非熒光)之間的隨機(jī)切換,在特定的時(shí)間內(nèi),利用組合激光束(激活和激發(fā)激光束)照射使熒光團(tuán)顯示出熒光開(kāi)關(guān)或閃爍,熒光團(tuán)的隨機(jī)光開(kāi)關(guān)在每一幀圖像中只產(chǎn)生少量的熒光點(diǎn),在收集到足夠的光子數(shù)后,通過(guò)二維高斯函數(shù)擬合的分析算法來(lái)幫助精確定位單個(gè)熒光團(tuán),最后通過(guò)合并所有單獨(dú)激活的熒光團(tuán)的位置重建超分辨圖像,這種方法通常被認(rèn)為是基于探針的單分子定位超分辨率顯微鏡[18]。該技術(shù)是通過(guò)數(shù)千幀熒光圖像的重建來(lái)獲得單幅高空間分辨率圖像,這種技術(shù)中最常見(jiàn)的是光激活定位顯微成像技術(shù)(PALM)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)超分辨成像技術(shù)(STORM),這兩種方法的機(jī)理如圖1c所示[7]。

光激活熒光蛋白具有特殊的光開(kāi)關(guān)特性,這類(lèi)熒光蛋白僅有在被激活后才會(huì)被激發(fā)而發(fā)出熒光,Betzig等[19]在2006年首次利用這種具有光開(kāi)關(guān)性質(zhì)的綠色熒光蛋白實(shí)現(xiàn)超分辨PALM成像。首先用405 nm激活光照射目標(biāo)區(qū)域激活少量的熒光蛋白,隨后再用561 nm的激發(fā)光使被激活的熒光蛋白發(fā)出熒光,采集并定位這些單分子的位置直至熒光分子被漂白,重復(fù)“激活-激發(fā)-定位-漂白”的過(guò)程后將所有定位點(diǎn)疊加后重構(gòu)得到超分辨圖像。STORM的原理與PALM的原理類(lèi)似,主要區(qū)別在于STORM使用的是光轉(zhuǎn)換熒光染料(Cy3-Cy5熒光對(duì))對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記,通過(guò)激光控制Cy5分子的“on-off”態(tài)從而獲得單分子信號(hào),通過(guò)重復(fù)“激活-激發(fā)-定位-漂白”的過(guò)程最終重構(gòu)出超分辨圖像。

與STED和SIM技術(shù)不同,單分子定位技術(shù)需要用特定的熒光探針標(biāo)記樣品,通過(guò)調(diào)控其開(kāi)關(guān)特性從而將空間上重疊的多分子熒光圖像在時(shí)間上進(jìn)行分離,并得到一系列子圖像,進(jìn)而利用單分子定位算法精準(zhǔn)定位熒光團(tuán)后將圖像進(jìn)行疊加從而重構(gòu)出超分辨圖像。在這種花費(fèi)時(shí)間分辨率來(lái)獲得高分辨率的成像過(guò)程中,具有高亮度、高光穩(wěn)定性、優(yōu)異開(kāi)關(guān)性質(zhì)的熒光材料成為實(shí)現(xiàn)高分辨率SMLM成像的關(guān)鍵因素[18]。目前已經(jīng)有一系列適用于SMLM成像的熒光材料被開(kāi)發(fā)出來(lái),其中具有光開(kāi)光性質(zhì)的熒光蛋白和有機(jī)小分子染料占據(jù)了主導(dǎo)地位。前述的具有光開(kāi)關(guān)性質(zhì)的綠色熒光蛋白是由野生GFP突變而得[10],并最早被應(yīng)用于SMLM成像,但其亮度較低導(dǎo)致成像的信噪比低,且最小采集時(shí)間約為150 ms/幀限制了其進(jìn)一步生物應(yīng)用[11]。隨著進(jìn)一步優(yōu)化,目前已經(jīng)有多種光激活熒光蛋白被開(kāi)發(fā),其發(fā)射波長(zhǎng)可覆蓋可見(jiàn)光區(qū),為成像提供了豐富的選擇。此外,具有更高亮度、更高光穩(wěn)定性、更小尺寸的小分子光開(kāi)關(guān)也獲得了普遍關(guān)注,光開(kāi)關(guān)類(lèi)熒光分子(如Cy5、Alexa Fluor 647)和光籠類(lèi)熒光分子(如Caged Q-rhodamine、Caged carboxyfluorescein)等已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于超分辨SMLM成像中[20,21]。

超分辨SMLM技術(shù)通過(guò)簡(jiǎn)單熒光“on-off”實(shí)現(xiàn)了在納米尺度的超高精度的熒光成像。但是它的缺點(diǎn)也很顯著,SMLM技術(shù)對(duì)于熒光團(tuán)的準(zhǔn)確定位來(lái)源于光子數(shù)的采集,又因?yàn)樾枰篃晒鈭F(tuán)稀疏發(fā)光的特點(diǎn),因此需要采集大量的子圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與重構(gòu),計(jì)算量大且耗時(shí)很長(zhǎng),難以對(duì)細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤[22]。此外,SMLM技術(shù)的樣品制備過(guò)程復(fù)雜且要求嚴(yán)格,包括反復(fù)照射導(dǎo)致的熒光團(tuán)光漂白等問(wèn)題使該技術(shù)在用于活體成像時(shí)仍有諸多問(wèn)題亟待解決。

1.4 3種超分辨成像技術(shù)比較

超分辨熒光成像技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)于生命科學(xué)的發(fā)展無(wú)疑有著舉足輕重的意義,這3種成像技術(shù)基于不同的原理均打破了衍射極限的桎梏,有力地推動(dòng)了生命科學(xué)的快速進(jìn)步[23]。在進(jìn)行活細(xì)胞成像時(shí),空間分辨率和時(shí)間分辨率之間的制衡會(huì)影響研究者對(duì)于這3種超分辨成像技術(shù)的選擇。SIM已經(jīng)被證明可以用于多細(xì)胞生物中的三維實(shí)時(shí)成像,但與其他技術(shù)相比,其較低的橫向及縱向分辨率均仍需進(jìn)一步優(yōu)化;STED盡管受限于成像視野小、高光漂白性的缺點(diǎn),但在高空間分辨率下可兼顧最佳的時(shí)間分辨率,并且已經(jīng)證明了可以進(jìn)行三色STED成像;而在SMLM超分辨成像時(shí),時(shí)間分辨率受定位所有熒光團(tuán)所需的時(shí)間限制,具體與熒光團(tuán)的開(kāi)關(guān)、發(fā)光性質(zhì)密切相關(guān)。隨著成像的橫向和縱向分辨率的提高,圖像采集速度、光漂白特性及多色、動(dòng)態(tài)成像的可能性也越來(lái)越成為超分辨熒光成像的關(guān)鍵決定因素。簡(jiǎn)而言之,這3種主要技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn),選用哪種技術(shù)需取決于樣品細(xì)節(jié)和所要研究的生物學(xué)問(wèn)題[7,11,24]。

2 超分辨成像的生物應(yīng)用

2.1 SIM

盡管相比于STED及SMLM, SIM對(duì)分辨率僅有中等程度的提高,但具有成像速度快、染料兼容性強(qiáng)、樣品制備簡(jiǎn)單等突出優(yōu)勢(shì),是一種特別適用于活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像的超分辨成像技術(shù)。目前的研究已經(jīng)證實(shí),SIM在呈現(xiàn)活細(xì)胞中復(fù)雜結(jié)構(gòu)之間的相互作用的研究中具有突出優(yōu)勢(shì)。

2007年,Schermelleh等[25]報(bào)道了3D-SIM用于動(dòng)物細(xì)胞成像的一個(gè)典型案例(見(jiàn)圖2a)。他們?cè)诙噙_(dá)3個(gè)通道中同時(shí)觀察固定的小鼠C2C12成肌細(xì)胞的染色質(zhì)、核層和核孔復(fù)合體。SIM突出的三維成像能力,使得與核層通道共定位的單個(gè)核孔復(fù)合體的分辨成為可能。此外,他們還能夠區(qū)分核膜內(nèi)外不同的孔復(fù)合蛋白。DNA結(jié)構(gòu)中的空洞導(dǎo)致核孔復(fù)合體的產(chǎn)生,表明DNA被排除在這些連接細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的孔之外。這一早期工作為三維分辨率倍增的寬場(chǎng)熒光顯微鏡、多色通道的同時(shí)成像以及使用傳統(tǒng)熒光團(tuán)標(biāo)記感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)提供了一個(gè)令人印象深刻的案例。后期研究者通過(guò)與電子顯微鏡對(duì)比,對(duì)3D-SIM的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證[26]。通過(guò)成像和分析玉米減數(shù)分裂過(guò)程中染色體中的突觸復(fù)合體發(fā)現(xiàn),這些結(jié)構(gòu)的側(cè)部單元?jiǎng)偤玫陀诔Ｒ?guī)光學(xué)顯微鏡可以分辨的極限。通過(guò)使用結(jié)合DNA的熒光團(tuán)和熒光標(biāo)記抗內(nèi)聚蛋白R(shí)EC 8α-kleisin同源物抗體,他們發(fā)現(xiàn):1.這種蛋白的分布沿橫向是不連續(xù)的;2.DNA的卷曲發(fā)生在突觸復(fù)合體形成之后;3.這些復(fù)合物被卷曲成左手雙螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)分析整個(gè)減數(shù)分裂過(guò)程中的這些結(jié)構(gòu),他們揭示了這些雙螺旋結(jié)構(gòu)在減數(shù)分裂的不同階段的短暫性質(zhì)。這項(xiàng)關(guān)于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的工作很快被其他3D-SIM研究跟進(jìn),他們分析了人類(lèi)中心體在不同細(xì)胞周期(如有絲分裂期和有絲分裂間期)的性質(zhì)。SIM熒光染色抗體的高特異性和SIM擴(kuò)展的三維成像深度使其成為分析細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(例如,結(jié)構(gòu)蛋白在所有維度上的共定位)的寶貴工具。

實(shí)際上，外國(guó)人名漢譯，肯定會(huì)受漢語(yǔ)習(xí)慣影響，但翻譯得讓它區(qū)別于中國(guó)姓名，則是一種創(chuàng)造。像大衛(wèi)、約伯、肖邦、富蘭克林、杰斐遜、韓禮德、牛頓（“頓”字大約有睹蘋(píng)果落地而悟之聯(lián)想）等譯名都是心血的結(jié)晶，不是參照譯音表可以簡(jiǎn)單翻譯出來(lái)的。嚴(yán)復(fù)說(shuō)“一名之立，旬月踟躕”，即使是人名，好的漢語(yǔ)翻譯也不是輕松可以得到的。

圖2 3D-SIM成像

SIM在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也開(kāi)始出現(xiàn)。在一個(gè)早期的例子中,Brown等[27]使用3D-SIM來(lái)確定皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白在NK細(xì)胞(natural killer cell)突觸附近的重構(gòu)。這種緊密肌動(dòng)蛋白網(wǎng)的重塑被認(rèn)為為NK細(xì)胞創(chuàng)造了所需的空間,使其分泌裂解顆粒到目標(biāo)細(xì)胞,從而殺死病毒感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。此外,Cogger等[28]首次用熒光顯微鏡對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中納米孔的結(jié)構(gòu)和分布進(jìn)行了成像。由于在此之前這一結(jié)構(gòu)只能用電子顯微鏡進(jìn)行研究,而電子顯微鏡樣品的制備需要嚴(yán)苛的程序,以至于有生物學(xué)家懷疑這些結(jié)構(gòu)可能是樣品制備過(guò)程中產(chǎn)生的污染。

微生物學(xué)是另一個(gè)率先引入SIM技術(shù)的領(lǐng)域。在該領(lǐng)域,目前集中在研究FtsZ的結(jié)構(gòu)和分布上(見(jiàn)圖2b)。FtsZ是真核細(xì)胞中微管蛋白的細(xì)菌同源物,它組裝成的Z環(huán)是引起細(xì)菌細(xì)胞分裂的原因。Strauss等[29]使用3D-SIM對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌成像時(shí)發(fā)現(xiàn),在這兩種菌類(lèi)中Z環(huán)是不連續(xù)的;長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)成像進(jìn)一步揭示了具有Z環(huán)的FtsZ位置是動(dòng)態(tài)的,并且在整個(gè)細(xì)胞分裂過(guò)程中保持異質(zhì)性。

SIM超分辨成像技術(shù)也被用于病毒結(jié)構(gòu)的分析。Horsington等[30]使用3D-SIM對(duì)單個(gè)痘苗病毒顆粒進(jìn)行成像,借助熒光成像來(lái)跟蹤該病毒的成熟和形態(tài)的變化。3D-SIM的三維特性使他們能夠?qū)⒉《景さ鞍譈5解析為圍繞該病毒的球形結(jié)構(gòu),從而提供了判斷病毒顆粒成熟程度的手段。

SIM超分辨成像適應(yīng)于活細(xì)胞成像的關(guān)鍵是照明模式產(chǎn)生和樣品掃描速度,目前已經(jīng)利用電光器件(如空間光調(diào)制器)實(shí)現(xiàn)。Kner等[1]以11幀/s的成像速度跟蹤了黑腹果蠅S2細(xì)胞微管蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)。大致同時(shí),Hirvonen等[31]展示了活COS-7細(xì)胞中線粒體運(yùn)動(dòng)的3D-SIM長(zhǎng)時(shí)間成像。Shao等[32]隨后對(duì)HeLa細(xì)胞中的線粒體和果蠅S2細(xì)胞中的微管進(jìn)行了快速3D-SIM成像,速度為每步5 s,累計(jì)成像次數(shù)超過(guò)50次。

除了以上提到的,SIM超分辨成像技術(shù)在植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究領(lǐng)域應(yīng)用也頗為廣泛,特別是胞間連絲的結(jié)構(gòu)、植物細(xì)胞間運(yùn)輸和通訊的微觀通道以及它們參與植物病毒的運(yùn)輸一直是最近研究的熱門(mén)。相繼出現(xiàn)的Hessian-SIM[33]和GI-SIM[34]分別從算法和照明兩個(gè)角度,實(shí)現(xiàn)了對(duì)SIM成像的時(shí)間和空間分辨率優(yōu)化。至此,科學(xué)家可以在長(zhǎng)達(dá)1 h的時(shí)間內(nèi),對(duì)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜結(jié)構(gòu)如線粒體嵴,細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜生理過(guò)程如線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用進(jìn)行更深入細(xì)致的研究。

2.2 STED

STED是第一個(gè)應(yīng)用于細(xì)胞成像的遠(yuǎn)場(chǎng)超分辨率成像技術(shù)[35]。自1994年發(fā)明以來(lái),已經(jīng)在多種細(xì)胞生物學(xué)問(wèn)題的研究中得到應(yīng)用。

在細(xì)胞結(jié)構(gòu)如脂膜、細(xì)胞骨架等研究中,STED技術(shù)同樣具有靈活的應(yīng)用。硅羅丹明具有光穩(wěn)定性強(qiáng)、波長(zhǎng)長(zhǎng)的特點(diǎn),它們可以很好地與市售775 nm的STED損耗激光結(jié)合。與較低波長(zhǎng)激光相比,長(zhǎng)波長(zhǎng)激光的光毒性顯著降低,因而硅羅丹明類(lèi)染料在活細(xì)胞成像中特別受歡迎。采用與多烯紫杉醇融合的硅羅丹明SiR-tublin對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行STED成像,獲得的分辨率相比于用微管結(jié)合蛋白融合蛋白標(biāo)記提高了兩倍。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的微管組織中心——中心體,活細(xì)胞STED成像觀察到其中心的中心粒是由9個(gè)三重微管組成的圓柱形結(jié)構(gòu)。通過(guò)STED成像測(cè)得其直徑為176 nm,相鄰最大值之間的極角約為40°,與中心粒的9倍對(duì)稱(chēng)性一致,這與通過(guò)電子顯微鏡(EM)測(cè)得的結(jié)果基本一致,并且STED超分辨熒光成像還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察,這是電子顯微鏡無(wú)法做到的。SiR-actin是另一種基于硅羅丹明的探針,它可以實(shí)現(xiàn)對(duì)F-actin特異性標(biāo)記。借助STED成像,研究者觀察到SiR-actin染色的原代大鼠海馬神經(jīng)元軸突邊緣呈環(huán)狀結(jié)構(gòu),沿軸突軸均勻分布,周期為180 nm。隨后,用SiR-tubulin進(jìn)一步證實(shí)了這一周期性重復(fù)的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)是神經(jīng)細(xì)胞的一般特征[37]。

細(xì)胞器之間相互作用及同一細(xì)胞器不同結(jié)構(gòu)之間的動(dòng)態(tài)變化通常發(fā)生在納米尺度上,這時(shí)只有依賴(lài)超分辨顯微成像才能實(shí)時(shí)觀察到。兩種及以上光譜有明顯區(qū)分的染料配合使用的多色STED成像,在細(xì)胞動(dòng)態(tài)研究大有可為。例如選取ATTO-590與硅羅丹明,配合蛋白標(biāo)簽可以實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞器相互作用或者同一細(xì)胞器不同結(jié)構(gòu)的雙色STED跟蹤(見(jiàn)圖3a)[38]。采用相同的熒光團(tuán)與標(biāo)記方式,科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)小GTP酶ARF1參與高爾基體運(yùn)輸中細(xì)長(zhǎng)管狀載體的形成(見(jiàn)圖3b,c)[39]。

圖3 活細(xì)胞STED成像

2.3 SMLM

包括PALM、熒光光激活定位技術(shù)(photoactivated localization microscopy, FPALM)和STORM在內(nèi)的單分子定位熒光顯微成像技術(shù)與STED的根本區(qū)別在于這些技術(shù)的成像原理是基于單分子定位的。這些技術(shù)背后的基本原理是,如果收集到足夠的光子,并且在衍射受限范圍內(nèi)沒(méi)有其他類(lèi)似發(fā)射的分子,單個(gè)分子的位置可以精確到1 nm或更好。這一概念由海森堡在20世紀(jì)30年代提出,并在20世紀(jì)80年代數(shù)學(xué)公式化,使得單分子跟蹤研究成為可能[40]。Gelles等[41]對(duì)驅(qū)動(dòng)蛋白修飾的小球的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了成像,精度為1～2 nm。這一工作成為許多其他單分子成像研究的基礎(chǔ)。

SMLM技術(shù)的突出優(yōu)勢(shì)在于空間分辨率。雙色STORM呈現(xiàn)的固定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的微管網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)格狀凹陷的組織,分辨率約為20 nm[42](見(jiàn)圖4a)。利用光學(xué)像散,Huang等[43]實(shí)現(xiàn)了三維(3D)STORM XY平面上20～30 nm的分辨率,z軸的分辨率可達(dá)到50 nm(見(jiàn)圖4b)。利用多焦平面成像技術(shù),Juette等[44]實(shí)現(xiàn)了三維FPALM成像,xy平面分辨率為30 nm,軸向分辨率為75 nm。

圖4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞BS-C-1中(a)微管和CCPs的雙色STORM成像和(b)3D-STORM成像

因此,活細(xì)胞SMLM用于跟蹤高時(shí)空分辨率的生物過(guò)程和結(jié)構(gòu)具有巨大的潛力,一個(gè)早期的例子是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)鐵蛋白簇的內(nèi)吞作用的表征[45]。在這些實(shí)驗(yàn)中,用Alexa 568標(biāo)記轉(zhuǎn)鐵蛋白,并通過(guò)SNAP標(biāo)簽用Alexa 647(通過(guò)電穿孔引入)標(biāo)記網(wǎng)格蛋白包被的凹坑。雙色SMLM圖像揭示了網(wǎng)格蛋白外殼和其中包裹的轉(zhuǎn)鐵蛋白在30 s內(nèi)的形態(tài)變化。其中轉(zhuǎn)鐵蛋白單獨(dú)的時(shí)間分辨率高達(dá)0.5 s,充分揭示了其集群的形成和內(nèi)化過(guò)程。

具有光開(kāi)關(guān)性質(zhì)的膜特異性小分子熒光團(tuán)使得觀察復(fù)雜細(xì)胞器膜的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)成為可能。例如,親脂性膜染料DiI(1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚碳菁)被用于研究海馬神經(jīng)元質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。借助STORM成像獲得的分辨率可以確定樹(shù)突棘頸的寬度,而一系列高時(shí)間分辨率(10 s)成像的獲得,為研究并揭示絲足和樹(shù)突棘動(dòng)力學(xué)和二者在不同區(qū)域的收縮和伸展提供了依據(jù)[46]。

隨著更多適用于SMLM成像的染料出現(xiàn),在更長(zhǎng)時(shí)間跨度更小時(shí)間分辨率上獲取活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)生理活動(dòng)成為可能。HMSiR及HIDE是其中有所突破的典型。HMSiR的開(kāi)關(guān)不需要高強(qiáng)度激光照射或額外試劑的添加,因此可以實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)時(shí)間的SMLM成像。對(duì)該分子而言,激光強(qiáng)度可以降低到SMLM中標(biāo)準(zhǔn)熒光團(tuán)所需的10%左右,大大減少了光漂白和光損傷。這允許在1 h的時(shí)間跨度內(nèi),以30 s的時(shí)間分辨率每隔10 min監(jiān)測(cè)微管的運(yùn)動(dòng)[47]。進(jìn)一步通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)將HMSiR熒光團(tuán)定位在不同的膜上,正如對(duì)其他HIDE探針?biāo)^察到的,親脂性的膜環(huán)境將促進(jìn)HMSiR分子的“開(kāi)-關(guān)”平衡進(jìn)一步向“關(guān)”的方向移動(dòng),使得密集標(biāo)記的膜結(jié)構(gòu)的成像成為可能。一個(gè)基于HMSiR的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)HIDE探針觀察到,細(xì)胞邊緣分布著寬度為50 nm的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管,這與以前的電鏡數(shù)據(jù)一致[48]。

以上這些研究證明了SMLM作為活細(xì)胞動(dòng)態(tài)研究的強(qiáng)大武器,但其應(yīng)用范圍的進(jìn)一步擴(kuò)大和延伸則需要更快的采集速度、更優(yōu)的圖像重構(gòu)算法以及亮度更高的小分子染料。

3 總結(jié)和展望

包括SIM、STED及SMLM等在內(nèi)的超分辨成像技術(shù)發(fā)展只有十多年的時(shí)間,但已經(jīng)迅速展現(xiàn)出巨大的潛力[10],并且空間分辨率的提高也正在縮小與電子顯微鏡之間的差距。幾十年來(lái),電子顯微鏡一直是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)最精細(xì)細(xì)節(jié)成像的主流技術(shù),但在樣本動(dòng)態(tài)活體實(shí)時(shí)成像上遠(yuǎn)不如熒光成像具有優(yōu)勢(shì),然而包括共聚焦成像在內(nèi)熒光顯微鏡技術(shù)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位和鑒定中極大地受限于分辨率。到目前為止,超分辨成像技術(shù)的主要用途集中在生物應(yīng)用上,用于研究小于200 nm結(jié)構(gòu)變化的信息[49]。在這些應(yīng)用中,超分辨成像技術(shù)通過(guò)詳細(xì)的形態(tài)測(cè)量表征,以高靈敏度和高特異性檢測(cè)和鑒定特定的生物分子。除了在結(jié)構(gòu)和形態(tài)表征方面與生物分子檢測(cè)、鑒定相結(jié)合外,超分辨成像技術(shù)也在迅速向相互作用圖譜、多靶點(diǎn)檢測(cè)和實(shí)時(shí)成像等領(lǐng)域擴(kuò)展。在后一類(lèi)應(yīng)用中,超分辨成像技術(shù)尤以更靈活的樣品染色,更高的標(biāo)記效率,更快更簡(jiǎn)單的讀數(shù),更溫和的樣品制備程序而越來(lái)越具有優(yōu)勢(shì)。熒光蛋白和熒光染料是超分辨成像中主要使用的發(fā)色團(tuán),熒光蛋白具有標(biāo)記準(zhǔn)確和生物無(wú)毒的優(yōu)勢(shì),但隨著時(shí)空分辨提高所要求的熒光團(tuán)更高亮度和穩(wěn)定性的需求,化學(xué)工作者正更多地關(guān)注于新型熒光染料的開(kāi)發(fā)。超分辨成像技術(shù)的革新帶來(lái)了前所未見(jiàn)的微觀世界的樣貌,同時(shí)也激勵(lì)化學(xué)工作者從機(jī)理上深刻了解熒光染料構(gòu)效關(guān)系,從合成上開(kāi)發(fā)新型超分辨熒光染料,與各領(lǐng)域研究工作者做好交叉,進(jìn)一步借助超分辨成像技術(shù)探索微觀世界。此外,提高對(duì)超分辨顯微成像技術(shù)的認(rèn)識(shí),以及發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中納米級(jí)組織的前所未知的特征,也有助于研究者解決其他方法無(wú)法回答的全新的問(wèn)題。