W/O/W型黨參多糖納米乳免疫增強劑制備及性質(zhì)研究

時菲菲, 曹金花, 于生蘭, 楊海峰

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院動物藥學院，江蘇 泰州 225300)

黨參[Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.]，桔?？?Campanulaceae)黨參屬(Codonopsis)，一種被廣泛使用的藥食兩用植物，在動物臨床中常用于體倦無力、少食氣虛等癥狀的治療。黨參含有多糖、生物堿、甾醇、皂苷等多種有效成分，多糖是黨參中含量最高的天然生物活性物質(zhì)[1-2]，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[3]、調(diào)節(jié)血液循環(huán)系統(tǒng)[4]、抗衰老[5]等作用。近年來，黨參多糖作為免疫增強劑的應用研究成為熱點，對免疫器官、免疫細胞和免疫分子[6]都有較好的調(diào)節(jié)作用，給藥方式以直接口服或制備成普通口服液為主，存在給藥后易被胃酸及胃腸道內(nèi)的酶降解，降低給藥后生物利用度的問題，限制了藥效的發(fā)揮。

納米乳是粒徑在1～200 nm范圍內(nèi)的乳劑型藥物載體，具有穩(wěn)定性好、緩釋、生物利用度高等優(yōu)點，主要有O/W型、W/O型、W/O/W型和O/W/O型[7-8]，在藥物制劑應用中可根據(jù)生物活性物質(zhì)本身的物理化學特性和給藥特點選擇適合的類型。目前，對納米乳制劑的研究主要集中在W/O型和O/W型，而對W/O/W型和O/W/O型研究較少。W/O/W型和O/W/O型納米乳又稱復合型納米乳，在結(jié)構(gòu)上具有獨特的“兩膜三相”多室結(jié)構(gòu)[9]，不同的相可以溶解不同性質(zhì)的物質(zhì)，同時起到隔離保護、緩控釋、掩味的作用，因此，復合型納米乳是優(yōu)良的藥物載體。目前，復合型納米乳在獸藥方面已應用到維生素[10]、抗菌藥物[11]、非水溶性驅(qū)蟲藥[12]等多種藥物，而作為免疫增強劑載藥系統(tǒng)的應用鮮見報道，未見W/O/W型黨參多糖納米乳免疫增強劑的相關報道。本研究利用黨參多糖構(gòu)建W/O/W型黨參多糖納米乳免疫增強劑載藥體系，以期有效增強黨參多糖的免疫調(diào)節(jié)作用，為黨參的合理利用和黨參多糖免疫增強劑新劑型開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黨參藥材購于珠海藥材公司；肉豆蔻酸異丙酯(IPM)購自上海麥克林生化科技有限公司；吐溫-80、HEL-40、Span-80、丙三醇、PEG-400均購自成都艾科達化學試劑有限公司。

試驗儀器包括：渦旋機(VORTEX-5 ，海門市其林貝爾儀器有限公司)、探頭超聲儀(03040518系列，江蘇偉禾生物科技有限公司)、激光粒度分析儀(Zetasizer Nano ZS，英國Malvern instrument公司)、透射電子顯微鏡(HT7700，日本Hitachi公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1黨參多糖的提取、純化和含量測定 黨參根切片，于40 ℃烘箱中烘干。稱取干燥的黨參片150 g，于300 mL蒸餾水中浸泡12 h，在90 ℃條件下浸提黨參多糖2.5 h，浸提結(jié)束后過濾，濾液于3 000 r·min-1離心10 min。取上清液并加入3倍體積的95%乙醇，混勻并靜置12 h后3 000 r·min-1離心15 min，收集沉淀并用蒸餾水復溶，用sevage試劑沉淀蛋白質(zhì)，上清液離心后濃縮并冷凍干燥得到黨參多糖。參照葉英等[13]的方法測定黨參多糖含量。

1.2.2W/O型初乳處方篩選 以IPM為油相，吐溫-80和HEL-40分別為乳化劑和助乳化劑，分別以體積比9∶1、8∶2、7∶3和6∶4混合乳化劑和助乳化劑形成混合物(Smix)，Smix再分別與油相以體積比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6;4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9和0∶10混合均勻后，在25 ℃水浴中，探頭超聲作用下緩慢滴加蒸餾水，至形成透明、均一的W/O初乳，并利用各組分用量以水相、油相和Smix為頂點構(gòu)建偽三元相圖，分析確定合適的油相、乳化劑、助乳化劑和水相用量，從而確定處方組成。

1.2.3W/O/W型納米乳處方篩選 以W/O型黨參多糖納米乳作為油相，蒸餾水作為水相，分別選取HEL-40、Span-80為乳化劑，丙三醇、PEG-400為助乳化劑，按照表1將乳化劑和助乳化劑以不同比例混合(Kv)，再加入處方比例的水相和油相，渦旋2 min，制備W/O/W型黨參多糖納米乳。

表1 W/O/W型黨參多糖納米乳處方篩選Table 1 Formulation screening of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemulsion

1.3 性質(zhì)考察

1.3.1外觀 觀察制備的W/O型初乳和W/O/W型黨參多糖納米乳，外觀應呈現(xiàn)澄清均一、透明或半透明狀態(tài)并伴有淡藍色乳光，平行光通過溶液時應出現(xiàn)丁達爾現(xiàn)象。

1.3.2類型鑒別 利用染色法分別鑒別W/O型初乳和W/O/W型黨參多糖納米乳類型。紅色油溶性染料蘇丹紅Ⅲ和藍色水溶性染料亞甲基藍加入到兩種乳劑中。連續(xù)相為油相時紅色擴散速度

快，可判定為W/O或O/W/O型；連續(xù)相為水相時藍色擴散速度快，可判定為O/W或W/O/W型。

1.3.3粒徑分布 利用Zetasizer Nano SZ?測定W/O/W型黨參多糖納米乳粒度分布和多分散指數(shù)(polydisperse index，PDI)。將納米乳用蒸餾水以1∶100比例稀釋，設定散射角為173°，在25 ℃條件下檢測。

1.3.4Zeta電位 利用Zetasizer Nano SZ?測定W/O/W型黨參多糖納米乳樣品電泳遷移率獲得Zeta電位值。將納米乳用1 mmol·L-1NaCl溶液以1∶250比例稀釋，在25 ℃條件下檢測。

1.3.5pH 在25 ℃條件下，利用pH計測定W/O/W型黨參多糖納米乳樣品pH。

1.3.6微觀形態(tài) 用蒸餾水將W/O/W型黨參多糖納米乳溶液1∶100稀釋，取適量滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，室溫下靜置20 min，用濾紙吸干。再滴加適量2%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負染5 min，室溫下自然揮干，利用透射電鏡觀察納米乳微觀形態(tài)。

1.3.7穩(wěn)定性考察 取適量黨參多糖納米乳樣品裝于透明玻璃螺口瓶內(nèi)，分別靜置于：①50 ℃條件下;②相對濕度75%、溫度25 ℃條件下;③4 000 lx光照條件下;在上述3種條件下分別進行高溫、高濕和光照試驗。各樣品分別在0、5、10 d取樣，檢查穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參多糖含量測定結(jié)果

對提取的黨參多糖純化，經(jīng)測定黨參多糖含量為15.66%±0.04%。

2.2 W/O黨參多糖初乳處方的組成

從圖1可以看出，當乳化劑和助乳化劑體積比為9∶1、8∶2、7∶3和6∶4時，偽三元相圖中形成W/O型初乳區(qū)域面積先增大后變小。當體積比為7∶3時面積最大，體積比為6∶4時面積最小，可見乳化劑與助乳化劑最佳體積比為7∶3。當乳化劑與助乳化劑體積比為7∶3時，Smix與油相體積比為8∶2～3∶7時，均可形成納米乳，考慮納米乳穩(wěn)定性及乳化劑和助乳化劑用量盡量低的原則，確定Smix與油相體積比為5∶4。

圖1 W/O型初乳處方篩選偽三元相圖Fig.1 Screening pseudo-ternary phase diagram of W/O colostrum prescription

2.3 W/O/W型黨參多糖納米乳處方的組成

不同處方條件下制備W/O/W型黨參多糖納米乳，粒徑和外觀考察結(jié)果如表2所示。由表2中數(shù)據(jù)可知，當表面活性劑與助表面活性劑分別為HEL-40和丙三醇，比例為1∶1和2∶1時，結(jié)果較好，肉眼觀察外觀均一，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，略顯乳白色，粒徑分別為(122.32±2.27) nm(PDI: 0.099±0.032)和(153.76±1.32)nm(PDI: 0.117±0.060)，靜置24 h內(nèi)穩(wěn)定。HEL-40和丙三醇比例為1∶2時，制備結(jié)束初始狀態(tài)外觀呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，略顯乳白色，靜置24 h后，外觀呈現(xiàn)乳白色，未出現(xiàn)破乳分層現(xiàn)象，這可能與穩(wěn)定性相關，靜置后乳滴微粒聚集，導致粒徑變大，出現(xiàn)了外觀從略顯乳白色到乳白色的變化。當乳化劑為Span-80時，粒徑在(1 020.22±4.39)～(1 392.08±2.76)nm范圍內(nèi)，靜置30 min后均出現(xiàn)分層；當乳化劑為HEL-40，助乳化劑為PEG-400時，粒徑大小為625.33～692.82 nm范圍內(nèi)，靜置6 h后均出現(xiàn)分層現(xiàn)象。可見，處方A′和A″為最佳W/O/W型黨參多糖納米乳處方的組成。

表2 不同處方下W/O/W型黨參多糖納米乳的粒徑和外觀Table 2 Particle size and appearance of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemlsions under different prescription conditions

2.4 W/O/W型黨參多糖納米乳的性質(zhì)

2.4.1外觀和類型 制備的初乳外觀透明，黨參多糖納米乳外觀半透明，均呈現(xiàn)澄清均一狀態(tài)，伴有淡藍色乳光，平行光通過溶液時出現(xiàn)丁達爾現(xiàn)象。經(jīng)染色法鑒別，初乳的紅色擴散速度快于藍色，為W/O型；黨參多糖納米乳的紅色擴散速度慢于藍色，為W/O/W型。

2.4.2Zeta電位和pH 表3顯示了處方A′和A″的Zeta電位和pH測定結(jié)果，2個處方的Zeta電位均接近于電中性，pH分別為6.3和5.5。

表3 處方A′和 A″下W/O/W型黨參多糖納米乳的Zeta電位和pHTable 3 Zeta potential and pH of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemlsions under formulation A′and A″

2.4.3微觀形態(tài) 透射電鏡觀察處方A′和A″的微觀形態(tài)如圖2所示。從圖2可以看出，2個處方制備的W/O/W型黨參多糖納米乳微粒大小均勻，無黏連，粒徑在100～200 nm范圍內(nèi)。

圖2 處方A′和 A″下W/O/W型黨參多糖納米乳透射電鏡Fig.2 Transmission electron microscopy micrographs of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemlsions under formulation A′and A″

2.4.4穩(wěn)定性試驗結(jié)果 處方A′和A″制備的W/O/W型黨參多糖納米乳穩(wěn)定性考察試驗結(jié)果見表4。2個處方的樣品在高溫、高濕及光照條件下穩(wěn)定性良好，外觀均一，略帶乳白色，無絮凝、破乳等現(xiàn)象，粒徑在高溫條件下略有增加，在高濕和光照條件下無明顯變化，提示樣品保存應注意避免高溫。

表4 穩(wěn)定性考察Table 4 Stability investigation

3 討論

由于納米乳載藥系統(tǒng)具有多種給藥途徑[14-15]，近年來該劑型得到越來越廣泛的研究，但多數(shù)研究集中于O/W型和W/O型，而對W/O/W型復乳的研究較少。W/O/W型納米乳也被稱為雙乳液，即乳液中的乳液，是由分散在油相中的水相形成一級W/O初乳，初乳進一步分散在水相中形成W/O/W復乳。利用該給藥系統(tǒng)可以通過口服給藥方式吸收胃腸道環(huán)境不穩(wěn)定的親水性化合物[16]，另外由于其特殊的“兩膜三相”結(jié)構(gòu)，該系統(tǒng)可以同時承載親水性化合物和親油性化合物[17]，該劑型的研究對拓寬藥物應用途徑具有重要意義。

由于多糖具有水溶性好的特點，近年來多糖納米乳制劑的研究多以W/O型為主。李樹鵬[18]制備了W/O型黃芪多糖納米乳免疫佐劑，可有效促進雞脾臟淋巴細胞NO的產(chǎn)生，刺激T細胞不同亞群調(diào)節(jié)Th細胞分泌細胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，效果優(yōu)于黃芪多糖；馬紅梅[19]制備了W/O型蒲公英多糖納米乳，能使小鼠免疫器官指數(shù)升高，促進免疫器官生長發(fā)育，刺激機體體液免疫、細胞免疫和非特異免疫，增強小鼠免疫力。作為液體獸用制劑，常以飲水方式給藥，W/O型納米乳外相為油相，無法與飲用水混溶，故在給藥時存在一定的局限性。本研究篩選出合適的油相、乳化劑和助乳化劑，成功制備了W/O/W型黨參多糖納米乳制劑，有效解決了上述問題，可與水以任意比例混溶，給藥方便，劑量精確。

W/O/W型納米乳的制備通常采用兩步法，第一步制備W/O型初乳，第二步制備W/O/W型復乳[20]，而在制備過程中通常需要輸入較高的能量，這極大地限制了該劑型在熱敏感藥物中的應用[21]。針對這一問題，近年出現(xiàn)了一步自乳化法制備W/O/W型納米乳[22]，該方法在低能條件下制備完成，但需要使用大量的乳化劑，易產(chǎn)生細胞毒性效應，且形成的乳劑粒徑較大，從而限制了給藥途徑。本研究通過繪制偽三元相圖篩選處方組成，利用超聲法制備W/O初乳，通過渦旋的方法完成W/O/W型復乳的制備，不易破壞藥物化學結(jié)構(gòu)，同時優(yōu)選出的2個處方乳化劑用量較低，為11%和12.5%，同時平均粒徑較小，為(122.32±2.27)和(153.76±1.32)nm，具有較高的穩(wěn)定性和安全性。

本研究利用偽三元相圖進行初乳處方篩選，采用兩步法制備了W/O/W型黨參多糖納米乳免疫增強劑。研究結(jié)果表明，微粒大小均勻，無黏連，粒徑在100～200 nm范圍內(nèi)，穩(wěn)定性好，為黨參多糖作為免疫增強劑應用提供了一種更優(yōu)的制劑選擇。本課題組將在此研究基礎上進一步考察黨參多糖免疫增強劑在動物體內(nèi)的免疫增強效果，并與黨參多糖溶液劑進行對比，同時對比研究其在動物體內(nèi)的緩釋效果，以更好地為在現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖中推廣應用奠定理論基礎，對推進畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重要意義。