實(shí)時熒光PCR 檢測在支原體肺炎診斷中的應(yīng)用價值

孫振宏，王茵娜，黃慰慰

泉州市婦幼保健院兒童醫(yī)院 （福建泉州 362000）

支原體是臨床中常見的病原菌，通過呼吸道傳播，具有較強(qiáng)的傳染性及反復(fù)性。支原體肺炎患兒會出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽等癥狀，且白細(xì)胞計數(shù)顯著增高，若不能及時接受治療，將會引發(fā)皮炎及中耳炎等病癥，嚴(yán)重時甚至還會并發(fā)心肌炎或腦膜炎，對患兒的身心健康造成影響[1]。臨床對于支原體肺炎的診斷多采用間接免疫熒光法檢測呼吸道病原體譜抗體IgM，該方法操作簡單，檢出率較高，但診斷靈敏度、特異度較低，加之患兒發(fā)病早期缺乏特異性癥狀，易出現(xiàn)誤診、漏診[2]。近年來，隨著臨床對分子生物學(xué)的研究不斷深入，PCR 檢測技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛。有研究顯示，實(shí)時熒光PCR 檢測的靈敏度、特異度均較高[3]。本研究探討實(shí)時熒光PCR 檢測在支原體肺炎診斷中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月至2019年11月我院收治的90例支原體肺炎患兒，男42例，女48例；年齡0.5～7.0歲，平均（3.54±0.14）歲；病程7～44 d，平均（27.24±2.36）d。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：存在發(fā)熱、呼吸急促；胸片出現(xiàn)異常改變；存在管狀呼吸音；血清支原體肺炎IgM ≥1∶160；患兒家屬簽署知情同意書同意參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有先天性心臟病的患兒；臟器功能存在障礙的患兒；臨床資料不完整的患兒；患有嚴(yán)重精神疾病的患兒。

1.2 方法

患兒入院后均完善有關(guān)檢查，采集血清標(biāo)本進(jìn)行間接免疫熒光法檢測呼吸道病原體譜抗體IgM，采集咽拭子進(jìn)行實(shí)時熒光PCR 檢測。（1）間接免疫熒光法檢測：檢測原理為，將稀釋的患者血清與包被有檢測基質(zhì)的載片溫育，若樣本為陽性，特異性IgM 抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合，第2次溫育時，結(jié)合的抗體與熒光素標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體反應(yīng)，此時可在熒光顯微鏡下觀察到特異性的熒光模型；檢測步驟包括準(zhǔn)備、加樣、溫育、沖洗、加樣、溫育、沖洗、封片，上述操作完畢后在顯微鏡下觀察熒光模型；結(jié)果判讀時，觀察組織器官和感染的細(xì)胞采用20×物鏡，觀察細(xì)胞基質(zhì)采用40×物鏡，激發(fā)濾鏡450～490 nm，分光鏡510 nm，阻擋濾鏡515 nm，光源100 W 汞燈，顯微鏡為歐蒙LED（EUROStar Bluelight，購置于上海兆儀光電科技有限公司）。（2）實(shí)時熒光PCR 檢測：將采集的咽拭子標(biāo)本與0.9%氯化鈉注射液混合，12 000 r/min 離心5 min，去上清，沉淀中加入50 μl DNA提取液充分混勻，100 ℃恒溫處理（10±1） min，12 000 r/min離心5 min，備用；提取DNA 后使用熒光PCR 進(jìn)行定量檢測，儀器選擇ABI7500型實(shí)時熒光定量PCR 儀（蘇州貝瑞儀器有限公司），試劑盒選擇中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的肺炎支原體核酸定量檢測試劑，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)

比較免疫熒光法和實(shí)時熒光PCR 檢測的檢出率，并繪制ROC 曲線，分析兩種方法單獨(dú)及聯(lián)合檢測的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，繪制ROC 曲線，分析診斷效能，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法的檢出率比較

實(shí)時熒光PCR 檢測的檢出率高于間接免疫熒光法檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 兩種方法的檢出率比較（90例）

2.2 兩種方法單獨(dú)及聯(lián)合檢測的診斷效能

ROC 曲線結(jié)果表明，聯(lián)合檢測的診斷靈敏度、特異度均高于兩種方法單獨(dú)檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2和圖1。

表2 兩種方法單獨(dú)及聯(lián)合檢測的診斷效能

圖1 不同檢測方法在小兒支原體肺炎中的診斷ROC 曲線

3 討論

支原體肺炎是一種經(jīng)呼吸道傳播的疾病，臨床表現(xiàn)無特異性，極易出現(xiàn)漏診、誤診的狀況，很多患兒不能得到及時治療，導(dǎo)致病情逐漸惡化，嚴(yán)重影響患兒的身心健康及生命質(zhì)量[4]。該病患兒通過X 線片檢查多發(fā)現(xiàn)肺部紋理明顯增多，需采集血清、痰或咽拭子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，檢測方法多以間接免疫熒光法測定為主，該方法可直接對病原體抗體進(jìn)行檢測，具有操作方便、速度快等特點(diǎn)，但其診斷靈敏度、特異度較低，極易出現(xiàn)假陽性，且僅適用于患兒體內(nèi)存在抗體的情況，局限性較大，性價比較低[5]。

隨著我國醫(yī)療診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，臨床發(fā)現(xiàn)實(shí)時熒光PCR 檢測對支原體肺炎的診斷準(zhǔn)確性較高。實(shí)時熒光PCR 檢測是一種新興的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，可同時擴(kuò)增多個標(biāo)本，直接反映患兒的感染情況[6]；該方法可通過探針實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增時的熒光信號，不必進(jìn)行配膠、電泳等操作，可進(jìn)一步縮短檢測時間，同時還能提高診斷準(zhǔn)確性[7]；加之該方法的診斷靈敏度、特異度較高，對傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的依賴性較低，更利于在臨床推廣應(yīng)用；但該方法對樣本的采集和操作環(huán)境要求較高，若樣本的處理出現(xiàn)差錯，會影響診斷結(jié)果，增加檢測難度，因此，需注意提高檢測人員的操作能力及綜合素養(yǎng)，避免人為因素影響檢測結(jié)果[8]。目前，實(shí)時熒光PCR 檢測是唯一一個將基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量的方法，且檢驗(yàn)操作較為智能。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測的診斷靈敏度、特異度均高于兩種方法單獨(dú)檢測（P<0.05）。

綜上所述，實(shí)時熒光PCR 檢測用于支原體肺炎診斷中能獲得較高的檢出率，聯(lián)合間接免疫熒光法檢測能提高診斷靈敏度、特異度。