樹突細胞免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

林 妍，孫海明，徐廣宇

(1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)引起的主要致命傳染病，2019年全球約有1 000萬人感染結(jié)核病[1].先天免疫應(yīng)答在預(yù)防結(jié)核病發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，巨噬細胞和DCs可以感知結(jié)核分枝桿菌的存在，是最初被感染的細胞，這些細胞分泌介質(zhì)，產(chǎn)生炎癥信號，通過驅(qū)動T淋巴細胞的激活和分化清除感染效應(yīng)[2-3].結(jié)核分枝桿菌除能破壞巨噬細胞的防御機制，還能干擾DCs的功能，DCs是宿主免疫系統(tǒng)的主要抗原呈遞細胞，在連接先天免疫和適應(yīng)性免疫過程中具有核心作用.在被結(jié)核分枝桿菌感染后，DCs從肺部遷移到引流淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)向T淋巴細胞呈遞抗原，協(xié)調(diào)抗細菌感染的免疫過程并最終決定疾病的結(jié)局[4-5].而在DCs應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌感染過程中，宿主基因表達的變化可以影響其龐大的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進而調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答相關(guān)的進程與通路.因此，系統(tǒng)地、深入地挖掘DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌致病機制及宿主感染免疫機制具有重要意義.

本研究通過收集NCBI GEO datasets數(shù)據(jù)庫中結(jié)核分枝桿菌感染DCs模型的芯片表達譜數(shù)據(jù)(感染組130例，對照組129例)，篩選出感染組相對于對照組DCs中表達差異的基因，初步構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌感染DCs中異常表達的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Gene regulatory network)，以篩選可能在結(jié)核分枝桿菌感染宿主DCs中存在的重要分子調(diào)控模塊，挖掘DCs向T淋巴細胞呈遞抗原過程中協(xié)調(diào)抗細菌免疫的顯著功能模塊，為發(fā)現(xiàn)宿主免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌的關(guān)鍵特征提供理論依據(jù).

1 實驗材料

數(shù)據(jù)庫與分析軟件：研究通過NCBI GEO data sets數(shù)據(jù)庫收集結(jié)核分枝桿菌感染DCs的實驗組與未感染的DCs對照組芯片表達譜數(shù)據(jù)；通過R語言limma包及ggplot2包分別分析差異基因表達譜數(shù)據(jù)及其差異基因的統(tǒng)計學(xué)特征，并通過DAVID(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)[6]在線分析工具對差異表達基因進行GO功能注釋分析與Pathway富集分析.通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫(Transcriptional Regula- tory Element Database，TRED)[7]篩選轉(zhuǎn)錄因子與預(yù)測的調(diào)控靶基因，應(yīng)用Cytoscape對篩選出的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因進行基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、可視化基因間的調(diào)控模式以及分子功能調(diào)控模塊；通過STRING[8]數(shù)據(jù)庫對基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)做進一步蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，深入洞悉核心調(diào)控基因.

2 實驗方法

2.1 表達譜數(shù)據(jù)的收集與分析

2.2 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過TRED數(shù)據(jù)庫篩選出結(jié)核分枝桿菌感染DCs中差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，并篩選出預(yù)測調(diào)控的靶基因，應(yīng)用Cytoscape構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌感染DCs中異常表達的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并挖掘分子功能模塊，篩選關(guān)鍵基因.

2.3 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中差異基因的功能注釋與通路富集分析

應(yīng)用DAVID在線分析工具整合KEGG數(shù)據(jù)庫，對DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的差異基因進行功能注釋與通路富集分析，對分析結(jié)果通過R語言ggplot2包進行可視化分析.

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

對結(jié)核分枝桿菌感染DCs中異常表達的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的靶基因通過 STRING數(shù)據(jù)庫作基因的蛋白間相互作用分析，即PPI網(wǎng)絡(luò)分析.結(jié)果通過 Cytoscape以網(wǎng)絡(luò)的形式展示，用不同顏色的節(jié)點顯示每個基因的相關(guān)程度，目的是找到最高程度的節(jié)點，以尋找可能在結(jié)核分枝桿菌感染宿主過程中對DCs行使免疫功能發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因.

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用受試者工作曲線(ROC 曲線)分析結(jié)核分枝桿菌感染DCs中關(guān)鍵基因表達的特征差異，使用GraphPad Prism 8.0軟件繪制 ROC 曲線，計算曲線下面積(AUC)，通過ROC曲線判斷異常表達的關(guān)鍵基因的特異性與靈敏度，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

3 結(jié) 果

3.1 結(jié)核分枝桿菌感染DCs中差異基因表達譜篩選結(jié)果

從NCBI GEO datasets數(shù)據(jù)庫中收集到結(jié)核分枝桿菌感染DCs的感染組芯片130例，未感染對照組芯片129例，均來自GSE34151數(shù)據(jù)集.芯片具體信息見表1.

表1 芯片表達譜數(shù)據(jù)Tab.1 Data of chip expression profile

通過分析表達譜數(shù)據(jù)，篩選出結(jié)核分枝桿菌感染DCs實驗組中差異表達基因共1 398個，其中，上調(diào)表達基因739個，下調(diào)表達基因659個.表達差異最為顯著的20個上調(diào)基因及20個下調(diào)基因見表2.

表2 結(jié)核分枝桿菌感染DCs中部分差異基因Tab.2 Partial differential genes in DCs of Mycobacteriumtuberculosis infection

圖1A火山圖分析和圖1B聚類分析顯示：對篩選出的差異基因作統(tǒng)計學(xué)分析，差異基因能夠區(qū)分實驗組與對照組，且趨勢明顯.

A.結(jié)核分枝桿菌感染DCs中差異表達基因火山圖分析(紅色表示上調(diào)表達基因，綠色表示下調(diào)表達基因)；B.結(jié)核分枝桿菌感染DCs中差異表達基因聚類分析(橙色顏色深淺表示差異基因表達趨勢高低).圖1 火山圖分析和聚類分析Fig.1Volcano map analysis and cluster analysis

3.2 結(jié)核分枝桿菌感染DCs中異常表達的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于以上分析結(jié)果，整合TRED數(shù)據(jù)庫獲得轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控的靶基因共90個，層次聚類分析顯示：結(jié)核分枝桿菌感染DCs組(TB)中異常表達的90個轉(zhuǎn)錄因子及靶基因與未感染DCs組(Control)表達趨勢存在差異，上調(diào)與下調(diào)表達模式清晰，說明樣本的重復(fù)性較好，能很好地區(qū)分實驗組與對照組.見圖2.應(yīng)用 Cytoscape對篩選出的90個異常表達轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖 3A.網(wǎng)絡(luò)中共包含 15個 轉(zhuǎn)錄因子與 75個靶基因，進一步通過MCODE算法工具將基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中顯著功能模塊提取出來.見圖3B.結(jié)果顯示：獲得DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌過程中的顯著功能基因有CREB1、IL6、CEBPA和CCND1.

3.3 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)差異表達基因功能與通路分析結(jié)果

應(yīng)用DAVID在線分析工具整合KEGG數(shù)據(jù)庫分析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中90個差異表達的基因，功能分析顯示：這些差異基因與感染應(yīng)答、免疫應(yīng)答和蛋白結(jié)合功能密切相關(guān).見圖4A.通路富集分析顯示：這些差異表達基因與TNF信號通路、細胞因子-細胞因子信號通路及結(jié)核通路相關(guān).見圖4B.網(wǎng)絡(luò)中差異基因與保護性免疫過程或信號通路相關(guān)性較大，其中結(jié)核通路顯著功能模塊分布信息見表3.包含顯著功能模塊的CREB1與IL6初步確定為關(guān)鍵基因，對網(wǎng)絡(luò)中90個差異基因作疾病相關(guān)性分析，結(jié)果顯示與免疫方面疾病最為相關(guān).見表4.

每一行代表差異表達基因，每一列代表一個樣本(DCs感染組和未感染對照組)；紅色表示基因表達上調(diào)，綠色表示基因表達下調(diào).圖2 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中90個差異表達基因?qū)哟尉垲惙治鯢ig.290 differentially expressed genes in gene regulatory network hierarchy clustering analysis

A.基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(藍色菱形表示轉(zhuǎn)錄因子，紅色橢圓表示上調(diào)表達基因，綠色橢圓表示下調(diào)表達基因)；B.關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò).圖3 結(jié)核分枝桿菌感染DCs中基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)Fig.3Gene regulatory networks and key subnetworks in Mycobacterium tuberculosis infected DCs

A.GO 功能分析；B.Pathway通路分析.圖4 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)差異基因前 30 個顯著功能與通路分析Fig.4Analysis of the top 30 significant functions and pathways of differential genes in the gene regulatory network

表3 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中顯著功能模塊基因在結(jié)核通路中的富集信息Tab.3 Enrichment information of significant functional modules of gene regulatory network in tuberculosis pathway

表4 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 90 個基因疾病相關(guān)性分析Tab.4 Genetic association db disease class analysis of 90 genes in the gene regulatory network

表4(續(xù))

3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

對DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因進一步行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并通過MCODE計算工具提取關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò).見圖5.PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)由21個節(jié)點組成，節(jié)點顏色越深表示其節(jié)點度越高，節(jié)點度統(tǒng)計結(jié)果見表5.其中節(jié)點度Degree顯著前5位基因依次是IL6、IL1B、STAT1、ICAM1和CCL2，節(jié)點度依次是56、45、43、39和37.對PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)進一步行功能與通路分析，結(jié)果見圖6A和6B，提示這些異常表達的基因在DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌感染過程中與感染應(yīng)答功能和TNF信號通路相關(guān)性最大，其基因列表見表6.而通過分析發(fā)現(xiàn)IL6參與多條功能條目與通路，其異常表達可能在DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌進程中發(fā)揮重要作用.

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果及關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)提取結(jié)果Fig.5PPI network analysis results and key subnetwork extraction results

表5 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度Tab.5 Key sub-network node degree of PPI network

圖6 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)GO功能分析與Pathway分析結(jié)果Fig.6GO analysis and Pathway analysis results of key subnetworks of PPI network

表6 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)顯著功能與通路信息Tab.6 Significant function and pathway information of key subnetworks in PPI network

3.5 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

通過綜合基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的顯著功能模塊分析與其PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，可以初步確定異常表達調(diào)控的CREB1與IL6可能影響宿主DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌的過程.在此基礎(chǔ)上，進一步采用ROC曲線分析CREB1與IL6表達是否與結(jié)核分枝桿菌感染DCs臨床病理過程相關(guān).CREB1與IL6作為結(jié)核分枝桿菌感染DCs過程顯著功能模塊中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和靶基因，其ROC 曲線下面積(AUC)分別為 0.911 4和0.963 6，特異性和敏感性均較高，說明 CREB1與IL6表達可能是表征結(jié)核分枝桿菌感染DCs進程有價值的標(biāo)志物.見圖7A和7B.

4 結(jié) 論

在本研究中，我們通過分析芯片表達譜數(shù)據(jù)構(gòu)建了DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌過程中異常表達的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并依據(jù)MCODE計算工具k-core值提取了該基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的顯著功能模塊，包括CREB1、IL6、CEBPA和CCND1 4個差異表達的基因，其中，CREB1與CEBPA為轉(zhuǎn)錄因子，與IL6和CCND1均有預(yù)測調(diào)控關(guān)系.通過對基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中全部基因進行功能分析與通路分析，結(jié)果顯示：網(wǎng)絡(luò)中差異基因與保護性免疫過程或信號通路相關(guān)性較大，且在結(jié)核通路中有顯著功能模塊基因分布，為CREB1與IL6.進一步對基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并提取關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點度Degree最顯著的基因為IL6，且在顯著功能與通路(inflammatory response與TNF signaling pathway)上均有IL6的分布信息，而CREB1與IL6有預(yù)測調(diào)控關(guān)系.ROC曲線分析顯示：CREB1和IL6與DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌臨床病理特征相關(guān)性較高，并作為結(jié)核分枝桿菌感染DCs過程顯著功能模塊中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和靶基因，其ROC 曲線下面積(AUC)分別為 0.911 4和0.963 6，特異性和敏感性均較高，提示 CREB1與IL6的異常表達可能是表征結(jié)核分枝桿菌感染DCs進程有價值的標(biāo)志物.

DCs是必要的抗原呈遞細胞(Antigen presenting cells，APCs)，通過直接的細胞-細胞相互作用和/或細胞因子的產(chǎn)生激活T淋巴細胞，協(xié)調(diào)先天炎癥免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫[9-10].在人類和小鼠中DCs有幾種亞型，以表面標(biāo)記物和功能為特征，一般來說，DCs亞群來自骨髓前體，它們通過血液或淋巴系統(tǒng)定植于外周組織[10-12].肺部樹突狀細胞分布于上皮下、間質(zhì)和胸膜腔室，通常以未成熟抗原提呈細胞的形式存在，由于DCs具有啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)的能力，它們被認為是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的主要靶點[13].DCs可以感知結(jié)核分枝桿菌的存在，正是由于結(jié)核分枝桿菌感染的炎癥狀態(tài)能夠誘導(dǎo)引流淋巴結(jié)的DCs成熟，DCs通過分泌介質(zhì)產(chǎn)生炎癥信號驅(qū)動清除結(jié)核分枝桿菌感染所必需的T淋巴細胞的活化與分化[2].

cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(The cAMP response element-binding protein，CREB)是細胞增殖和凋亡所需的基本核轉(zhuǎn)錄因子，即CREB1，CREB1在所有器官中廣泛表達，是增殖、生長、生存和分化等多個生物過程所必需的轉(zhuǎn)錄因子[14-16].CREB1由多種生長因子和炎癥信號誘導(dǎo)產(chǎn)生，隨后介導(dǎo)包含cAMP反應(yīng)元件的基因轉(zhuǎn)錄.一些免疫相關(guān)基因擁有這種cAMP反應(yīng)元件，包括IL2、IL6、IL10和TNF-α[17-20].Interleukin 6(IL6)是一種多效促炎細胞因子，其表達量的增加是許多人類慢性炎癥疾病的標(biāo)志[21-22].有研究[23]表明：在結(jié)核病患者外周血單核細胞經(jīng)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白ESAT6/CFP10刺激培養(yǎng)后，在細胞上清液中也可檢測到高表達量的IL6；在自噬對DCs成熟與抗結(jié)核分枝桿菌免疫影響的研究中，通過BCG(Bacillus Calmette Gue’rin)誘導(dǎo)DCs成熟，CD86 和 HLA-DR表達增加，自噬刺激后發(fā)現(xiàn)IL6也隨之產(chǎn)生，提示自噬可以促進細胞因子的產(chǎn)生和共刺激分子的表達，而IL6的高表達可能更有效地促進T細胞的免疫應(yīng)答.

綜上所述，本研究初步構(gòu)建了DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并篩選出網(wǎng)絡(luò)顯著功能模塊，主要分析了在結(jié)核信號通路上具有預(yù)測調(diào)控關(guān)系的轉(zhuǎn)錄因子CREB1與其靶基因IL6，推測它們的異常表達調(diào)控在DCs免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并分析了CREB1和IL6與DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌臨床病理特征相關(guān)性，其特異性與靈敏度均較高，提示 CREB1與IL6的異常表達可能是結(jié)核分枝桿菌感染DCs進程中有價值的標(biāo)志物，也可能是宿主在感染結(jié)核分枝桿菌后由先天免疫過渡到適應(yīng)性免疫的信號.構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對于DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌過程中重要調(diào)控因子及其靶基因的鑒定是一個重要的研究渠道與工具，這一系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法為進一步闡明重要基因調(diào)控免疫應(yīng)答的分子機制提供了理論基礎(chǔ).以上分析結(jié)果可以幫助我們在后續(xù)開展DCs免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌功能的體內(nèi)體外實驗及未來尋找治療結(jié)核病的新策略提供研究方向.