苯酚生物降解菌的篩選及降解特性研究

摘要：苯酚是一種存在于環(huán)境中對人體和動物有害的有機物，并且自然條件下難以降解。本文旨在通過對苯酚降解微生物的探究來尋求一種綠色環(huán)保的苯酚生物處理辦法。首先通過苯酚梯度平板來篩選出高濃度苯酚耐受菌株，將其接入斜面保藏;再使用以苯酚為單碳源的液體LB培養(yǎng)基進行篩選，得到能夠利用苯酚的菌株;之后再使用不同濃度苯酚的平板進行接種培養(yǎng)，進一步得到更加高耐受苯酚菌株，期間我們還可以進行單菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色等方法對菌株進行研究;最后通過單因素隨機試驗的方法來探究不同濃度苯酚對同一菌株生長的影響。

關鍵詞：苯酚;微生物;紫外分光光度計;F檢驗

1 引言

苯酚，也叫石炭酸，分子式C6H5OH，是具有特殊氣味的無色針狀晶體，有毒，常存在于皮革制造、合成纖維、煉油、染料、醫(yī)藥及殺菌劑、造紙等工業(yè)生產(chǎn)中，是煤氣廠、纖維廠、煉油廠及焦化廠等工業(yè)排放廢水中含量較多的物質(zhì)，如果處理不當苯酚容易吸附于底泥上。本次采樣點為河南理工大學南校區(qū)第二圖書館后方的污水河流中，采樣為潮濕岸土和黑色污泥的混合土。由于該河流途徑污水處理廠，因此推測苯酚降解菌較多。

當今涌現(xiàn)出了許多處理苯酚的方法，最主要的為電化學法，生物降解法和物理的吸附法，而其中最佳的方法還數(shù)生物降解法，生物降解法所具有的成本低、二次污染少以及經(jīng)濟高效等優(yōu)點。因此本文主要對苯酚生物降解菌的篩選及降解特性研究進行綜述，為大家提供一個新的研究思路。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 菌株來源

從河南理工大學第二圖書館后方污水溝中采集的黑色污泥和潮濕岸土混合物，現(xiàn)取現(xiàn)用。

2.1.2 實驗器材及試劑

高壓滅菌鍋;恒溫培養(yǎng)箱;恒溫搖床;超凈工作臺;紫外分光光度計;電爐;電子天平;水浴鍋;冰箱;三角瓶;玻璃棒;培養(yǎng)皿;試管;刻度滴管;玻璃珠;涂布棒;接種環(huán)等。

苯酚;1mol/L 氫氧化鈉;1mol/L HCL

2.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，（瓊脂20g/L），PH7.4 ～ 7.6，苯酚視情況而加。

以苯酚為單碳源的液體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g，NaCl10.0g/L，苯酚800mg/L，PH：7.2 ～ 7.4

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g/L，NaCl10.0g/L，酵母粉5.0g/L，PH：7.2 ～ 7.4

2.2 實驗方法

2.2.1 苯酚耐受性菌株的初選：

取10g混合土壤倒入裝有玻璃珠的含90ml無菌水的三角瓶中制成10-1土壤懸液，繼續(xù)稀釋做成不同稀釋度。每個濃度做平行對照，分別涂布到含有300mg/L牛肉膏蛋白胨梯度平板中，并置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天。長出菌落后，挑取高濃度生長的單菌落5個并接種于斜面培養(yǎng)基上，進行編號后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 以苯酚為單碳源的菌株的篩選

先將斜面保存的菌落進行新斜面的轉(zhuǎn)接，刮取剩余菌體并用無菌水稀釋后，倒入以苯酚為單碳源的液體LB培養(yǎng)基中，分別編號。在剛接種后使用空白對照先測量其初始OD600，150r/min條件下培養(yǎng)1～2天，期間可多次測量其OD600，觀測其吸光度變化從而評估其生長狀況。

2.2.3 高耐受性苯酚降解菌的篩選及觀察

獲得生長狀況較好的菌株之后，再用800mg/L、1200mg/L，1600mg/L三個濃度對其進行篩選，每個濃度做平行對照，可獲得耐受能力好、降解程度高的苯酚降解菌。涂布接種并培養(yǎng)1～2天后，可觀察到平板上長出的單菌落，可對其個體形態(tài)、群體特征、生理生化等特點進行觀察。還可挑取菌落進行革蘭氏染色實驗來判斷所選菌落是革蘭氏陽性菌還是陰性菌。

2.2.4 苯酚降解菌降解特性研究

取生長較好的菌株以濃度作為單因素進行完全隨機試驗，以1000mg/L、1400mg/L、1800mg/L為三個濃度變量，每個濃度設置平行對照，每個三角瓶都加入100ml含有苯酚的LB液體培養(yǎng)基，在9個三角瓶中加入等量（1ml）菌懸液后先測量其初始OD600，然后在恒溫搖床中于30℃，150rpm條件下培養(yǎng)24h并進行OD600的測定，對比前后OD600的差值并進行F檢驗的數(shù)據(jù)分析計算。

3 結(jié)果與分析

3.1 苯酚耐受性菌株的初選

經(jīng)過初步的篩選獲得五株高濃度耐受苯酚菌株，將其分別編號為①②③④⑤，接種斜面后長勢良好。

3.2 以苯酚為單碳源的菌株的篩選

培養(yǎng)后各瓶液體均變得較為渾濁其中①②③⑤在培養(yǎng)0～27h內(nèi)均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，僅有④號菌株一直緩慢上升。

3.3 高耐受性苯酚降解菌的篩選及觀察

①④號菌株長出單菌落較密，可能由于菌懸液濃度較高或涂布量較多。①號菌落形態(tài)觀察結(jié)果：小菌落，密集，潮濕，表面略微凸起，邊緣鋸齒狀，乳白色;④號菌落形態(tài)觀察結(jié)果：大菌落，稀疏，潮濕，表面略微凸起，邊緣鋸齒狀，周圍有透明帶，白色。通過革蘭氏染色觀察到這兩種菌株均為革蘭氏陽性菌。

3.4 苯酚降解菌降解特性研究

通過F檢驗可得其F*=7.804，

由于F0.05（2，6）

因此各處理之間差異顯著，表明不同濃度苯酚對同一菌株生長有影響。

4.小結(jié)

本文旨在提出一種苯酚生物降解菌的篩選及降解特性研究的方法和思路，讀者可根據(jù)自身具體情況進行相關實驗的變動與創(chuàng)新，通過多種方法進行完善總結(jié)才是做好探究性實驗的基礎性工作。

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作者簡介：李帥（1999-12-），男，回族，河南周口人，本科在讀，河南理工大學學生 生物技術(shù)專業(yè)。

河南理工大學資源環(huán)境學院 ?河南 ?焦作 ?454003