A型塞內(nèi)卡病毒研究進(jìn)展

廖迎新，范錦戴，張夢(mèng)茹，劉晨晨，章洋溢，孫顯月，陳金頂，趙明秋*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東茂名農(nóng)林科技職業(yè)學(xué)院，廣東 茂名 525000)

A型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A，SVA)，也稱為塞內(nèi)加谷病毒(Seneca valley virus，SVV)，是單股、正鏈RNA 病毒，屬于小RNA 病毒科塞內(nèi)卡病毒屬成員。該病毒感染可引發(fā)母豬水泡性相關(guān)疾病，并可導(dǎo)致新生仔豬急性死亡，影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。SVV-001是SVA的原形毒株，該毒株分離于2002年，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是PER.C6細(xì)胞中的污染物[1]。SVV-001對(duì)人體無毒，且具有溶瘤特性，因此該病毒被用于嘗試治療人的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[2]。SVV-001雖然能感染豬，但不能使豬致病[3]。2007年美國(guó)某屠宰場(chǎng)報(bào)道加拿大豬群出現(xiàn)水泡性疾病癥狀，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與SVA感染有關(guān)[4]。近年來，美國(guó)、加拿大、哥倫比亞、巴西、泰國(guó)和越南等國(guó)家均報(bào)道豬群感染SVA疫情[5-10]。2015年3月，廣東省某豬場(chǎng)發(fā)生國(guó)內(nèi)首例SVA感染疫情[11]。隨后，SVA疫情在我國(guó)其他省份陸續(xù)出現(xiàn)[12]。SVA感染嚴(yán)重影響母豬的生產(chǎn)效率及新生仔豬存活率，是養(yǎng)豬業(yè)的潛在威脅。為了給SVA防控提供有效信息，現(xiàn)對(duì)SVA病原學(xué)、流行情況、致病性、致病機(jī)理研究、疫苗研發(fā)、診斷及防控等方面進(jìn)行綜述。

1 SVA病原學(xué)簡(jiǎn)介

SVA是單股、正鏈RNA病毒，無囊膜，病毒粒子呈典型的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑25～30 nm[1]。其基因組全長(zhǎng)約7.3 kb，由5′-UTR、3′-UTR和1個(gè)大的ORF組成(圖1)。5′-UTR含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，40S核糖體亞基可與5′-UTR結(jié)合從而啟動(dòng)多聚蛋白前體翻譯，3′-UTR含有poly(A)。ORF編碼由P1、P2和P3組成的大蛋白前體。該蛋白前體可被病毒和細(xì)胞蛋白酶切割、加工并產(chǎn)生4種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Lpro、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)[1,13]。

圖1 SVA基因組結(jié)構(gòu)[13]

2 SVA國(guó)內(nèi)流行情況

2015年3月，廣東省某豬場(chǎng)的斷奶母豬出現(xiàn)鼻鏡水泡、跛行等疑似水泡疾病癥狀，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒、豬水泡病病毒和水泡性口炎病毒等水泡相關(guān)病原均為陰性，而SVA為陽(yáng)性，同時(shí)成功分離到SVA毒株CH-01-2015[11]。自2016年后，我國(guó)華南、華中、西南和東北等地區(qū)均發(fā)生SVA疫情[12]。根據(jù)基因組遺傳進(jìn)化分析，國(guó)內(nèi)SVA毒株至少可分為5種類型[14]，意味著SVA毒株的復(fù)雜多樣。也有報(bào)道稱國(guó)內(nèi)SVA分離毒株可分為USA-like和Canada-like毒株；而2017年以來，國(guó)內(nèi)流行毒株主要是USA-like毒株[15]。我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，養(yǎng)殖密度較大，區(qū)域間生豬調(diào)運(yùn)頻繁，為SVA的存在和傳播創(chuàng)造了有利條件。SVA是RNA病毒，該病毒在豬群中的持續(xù)存在和傳播加快了SVA基因組的變異和重組，給SVA的防控增添更大的難度[16-18]。

3 SVA致病性

研究發(fā)現(xiàn)，SVA感染母豬或育肥豬后，豬只體溫輕微升高，感染后3～5 d嘴唇、鼻子、舌頭和冠狀帶等部位形成水泡病變，病豬可出現(xiàn)嗜睡、厭食和跛行等臨床癥狀。SVA感染后出現(xiàn)短期的病毒血癥，1～10 d在血清中能檢測(cè)到病毒RNA。感染后21 d，仍然可從口鼻分泌物和糞便中分離出感染性病毒。感染后28 d，在口鼻分泌物和糞便中仍然可檢測(cè)到病毒RNA(圖2)[19-21]。JOSHI等[20]發(fā)現(xiàn)，育肥豬在感染后3～7 d，扁桃體、脾臟和淋巴結(jié)可觀察到淋巴樣增生。研究發(fā)現(xiàn)，不同毒株的致病性存在明顯差異，其毒力從低致病性到高致病性不等[15,22]。

圖2 SVA感染動(dòng)力學(xué)[21]

CHEN等[22]評(píng)估國(guó)內(nèi)2株SVA毒株(GD-S5/2018和GD04/2017)致病性，發(fā)現(xiàn)這2株SVA毒株均可感染豬，但毒力差異較大，GD-S5/2018感染導(dǎo)致豬只典型的水泡相關(guān)癥狀，而GD04/2017感染的豬只除了精神狀態(tài)差外，未出現(xiàn)任何典型臨床癥狀。除了導(dǎo)致母豬和育肥豬水泡性癥狀外，仔豬急性死亡也是SVA感染的主要特征。新生仔豬死亡率高達(dá)30%～70%，有時(shí)伴有昏睡、腹瀉或神經(jīng)癥狀[6]。

4 SVA致病機(jī)理

病毒感染實(shí)際上是病毒與宿主之間相互博弈的過程。病毒入侵宿主后，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)一系列免疫應(yīng)答，試圖達(dá)到清除病毒的目的。而病毒為了生存，則會(huì)采取一系列策略抵抗宿主免疫反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)免疫逃逸和自身復(fù)制。天然免疫反應(yīng)作為機(jī)體免疫應(yīng)答的重要組成部分，在病毒與宿主的互作中發(fā)揮著重要作用。其中，Ⅰ型干擾素信號(hào)通路作為天然免疫的關(guān)鍵組成部分，與SVA感染免疫密切相關(guān)。LI等[23]發(fā)現(xiàn)SVA感染可激活Ⅰ型干擾素信號(hào)通路，而RIG-Ⅰ功能缺失則抑制SVA感染過程中IFN-β和干擾素刺激因子MxA、ISG15和GBP1等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)SVA在PK-15細(xì)胞復(fù)制，表明RIG-Ⅰ對(duì)SVA感染過程Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的激活是必需的。WEN等[24]發(fā)現(xiàn)SVA感染可以誘導(dǎo)RIG-Ⅰ降解，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SVA 2C和3C蛋白通過Caspase信號(hào)途徑降解RIG-Ⅰ，從而抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生；而RIG-Ⅰ過表達(dá)則顯著抑制SVA復(fù)制。QIAN等[25]研究發(fā)現(xiàn)SVA通過3C靶向切割接頭蛋白MAVS、TRIF和TANK，從而抑制宿主Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。此外，3C還可切割宿主poly(A)結(jié)合蛋白(PABPC1)，下調(diào)宿主蛋白合成效率，從而促進(jìn)SVA復(fù)制[26]。XUE等[27]發(fā)現(xiàn)SVA感染降低PK-15細(xì)胞IRF3和IRF7蛋白表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SVA 3C與IRF3和IRF7互作，并降低IRF3和IRF7蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平，且IRF3和IRF7的降解抑制IFN-β、 IFN-α1、IFN-α4和ISG54轉(zhuǎn)錄，表明SVA 3C通過降解 IRF3和IRF7抑制IRF3和IRF7介導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答。同時(shí)，XUE等[28]還發(fā)現(xiàn)，SVA復(fù)制過程與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)密切相關(guān)，3C還具有去泛素化功能，可抑制RIG-Ⅰ、TBK1和TRAF3泛素化，進(jìn)而抑制IFN-β和ISG54表達(dá)，從而負(fù)向調(diào)控Ⅰ型干擾素信號(hào)通路。閆鳴昊等[29-30]發(fā)現(xiàn)敲除TPL2(MAP3K8/COT)基因促進(jìn)SVA復(fù)制，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TPL2基因調(diào)控SVA復(fù)制的過程可能與IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56表達(dá)抑制有關(guān)，表明TPL2在SVA感染過程中發(fā)揮抗病毒作用。WANG等[31]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素在機(jī)體抵抗SVA感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。唐曉鈺等[32]利用高通量測(cè)序分析了SVA感染的lncRNA差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)lncRNA靶基因主要富集于p53信號(hào)通路、RIG-Ⅰ樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)通路等。ZHU等[33]利用組學(xué)方法分析SVA感染細(xì)胞中l(wèi)ncRNA和mRNA差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)受調(diào)控的基因主要涉及宿主免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)lnc-MSTRG.18940.1沉默抑制SVA復(fù)制和TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8等炎性因子的產(chǎn)生。

已有研究表明，細(xì)胞凋亡和自噬等生物過程與SVA感染密切相關(guān)。FERNANDES等[34]研究發(fā)現(xiàn)SVA感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)3C蛋白水解活性對(duì)SVA誘導(dǎo)凋亡過程是必需的。王詠等[35-36]研究發(fā)現(xiàn)，SVA結(jié)構(gòu)蛋白VP1可與宿主促凋亡蛋白BAD在線粒體上發(fā)生互作，促進(jìn)凋亡蛋白Bax和Caspase 3的表達(dá)及活化，從而激活線粒體凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。LIU等[37]也證明SVA 2C和3C可通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，HOU等[38]研究發(fā)現(xiàn)，SVA可通過PERK和ATF6 UPR途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制。上述研究結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬在SVA感染免疫中發(fā)揮著重要作用。

此外，在SVA的傳播機(jī)制方面，XU等[39]發(fā)現(xiàn)外泌體介導(dǎo)SVA在細(xì)胞間的傳播，且SVA特異中和抗體不能阻斷外泌體介導(dǎo)的SVA細(xì)胞間傳播，揭示外泌體在SVA在傳播中的重要性。

5 SVA的診斷方法

SVA是國(guó)內(nèi)豬群中新流行的病原，其感染引起的臨床癥狀與口蹄疫、豬傳染性水泡病、水泡性口炎和豬水泡性皮疹等水泡性相關(guān)疾病相似，在臨床上很難對(duì)這些疾病進(jìn)行區(qū)別診斷，需借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)對(duì)其進(jìn)行確診。目前已有多篇文章報(bào)道SVA的分子診斷方法，如RT-ddPCR檢測(cè)方法[40]、基于探針的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法[41-43]、SYBR Green熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法[44]、RT-RPA快速檢測(cè)方法[45]和RT-LAMP檢測(cè)方法[46-47]等。其中，RT-RPA和RT-LAMP屬于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，不需要復(fù)雜的精密儀器，對(duì)于設(shè)施配置較為簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室而言，等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)可作為首選。另外，SVA的多種血清學(xué)診斷方法也已被建立，如間接ELISA[48-49]、競(jìng)爭(zhēng)ELISA[50-51]、間接免疫熒光技術(shù)[52]和病毒中和試驗(yàn)[50,53]等。諸多核酸檢測(cè)方法和血清學(xué)檢測(cè)方法的建立，為SVA感染的診斷、疾病監(jiān)控和流行病學(xué)調(diào)查等提供了強(qiáng)有力的工具。

6 SVA疫苗的研究進(jìn)展

目前，市場(chǎng)上尚無針對(duì)SVA的商業(yè)化疫苗，關(guān)于SVA疫苗研發(fā)的報(bào)道仍然不多。CHEN等[54]利用反向遺傳操作技術(shù)制備SVA標(biāo)記毒株，初步研究該毒株的生物學(xué)特性，為SVA 疫苗的研發(fā)提供了有力的工具。YANG等[55]利用SVA CH-FJ-2017毒株制備SVA候選滅活疫苗，并評(píng)估該候選滅活疫苗的免疫效果，發(fā)現(xiàn)免疫豬只產(chǎn)生較高水平的中和抗體，同時(shí)可抵抗SVA同源毒株攻擊，表明該候選滅活疫苗具有潛在的應(yīng)用前景。SHARMA等[56]利用反向遺傳操作技術(shù)制備SVA的弱毒株(rSVAm SacⅡ)，通過動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)該毒株已被致弱，且免疫該弱毒株的豬只可抵抗不同SVA毒株攻擊，表明該弱毒株是有潛力的候選疫苗毒株。

核酸疫苗和亞單位疫苗因其制備簡(jiǎn)單，安全性高，可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，也是疫苗研發(fā)中常用的策略。魏婷等[57]將SVA衣殼前體蛋白P12A基因和3C蛋白酶基因進(jìn)行融合，獲得融合基因P12A-3C并制備真核表達(dá)質(zhì)粒pCD-P12A-3C，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)免疫該質(zhì)粒的小鼠可產(chǎn)生較高水平抗體，初步證明該候選核酸疫苗的免疫效力。莫亞霞等[58]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)SVA衣殼蛋白VP0、VP1和VP3，發(fā)現(xiàn)這三者均能與豬的SVA陽(yáng)性血清發(fā)生特異反應(yīng)，且可組裝成五聚體，具有開發(fā)為SVA病毒樣顆粒疫苗的潛在價(jià)值。

國(guó)內(nèi)SVA毒株的基因組變異和重組現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)，流行毒株復(fù)雜多樣，給疫苗研發(fā)增加不少壓力。如何研發(fā)出可抵抗不同類型毒株攻擊的SVA疫苗是疫苗研發(fā)的重點(diǎn)。新型表位疫苗由于其安全、有效和研發(fā)周期短等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到科研工作者的青睞。FAN等[59]制備了針對(duì)SVA衣殼蛋白VP1和VP2的單克隆抗體，并利用這些抗體鑒定了VP1和VP2的多個(gè)線性B細(xì)胞表位，這些表位的鑒定將有利于揭示病毒致病機(jī)制，同時(shí)也有利于疫苗研發(fā)和檢測(cè)方法的建立。除了通過試驗(yàn)篩選，還可考慮利用基因組序列分析與預(yù)測(cè)等途徑，獲取SVA毒株保守的抗原表位，利用基因工程技術(shù)，制備新型的SVA表位疫苗。

7 SVA的防控

目前市場(chǎng)上尚無針對(duì)SVA的疫苗和抗病毒藥物，SVA的防控仍然存在一定的困難。根據(jù)獸醫(yī)科研工作者的建議[12,60]，結(jié)合養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)際，需采取綜合措施對(duì)SVA感染進(jìn)行防控。對(duì)規(guī)?；i場(chǎng)而言，良好的生物安全體系可將大部分病原微生物攔截在大門之外，同時(shí)也是SVA防控的關(guān)鍵。建立生物安全體系的配套設(shè)施、豬場(chǎng)引種或使用相關(guān)生物制品時(shí)進(jìn)行嚴(yán)格檢疫、實(shí)施嚴(yán)格的消毒防疫制度、豬群執(zhí)行全進(jìn)全出、建立科學(xué)飼養(yǎng)管理和樹立嚴(yán)格的防疫意識(shí)等，都是生物安全體系建設(shè)的重要組成部分。針對(duì)發(fā)病豬只的治療，尚無特效藥物，需將發(fā)病豬只進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，然后采取對(duì)癥治療。此外，科研工作者可考慮加快SVA 疫苗研發(fā)工作。目前豬群中接種的疫苗數(shù)量較多，再增加SVA的疫苗接種是否會(huì)加劇對(duì)豬群的應(yīng)激作用，從而造成不必要的負(fù)面影響，仍未可知。若SVA疫苗上市，建議對(duì)SVA經(jīng)常流行的區(qū)域進(jìn)行免疫接種，而不是盲目接種，以免增加豬群應(yīng)激。

8 小結(jié)

SVA感染可引起母豬或育肥豬出現(xiàn)水泡性臨床癥狀，并可引起新生仔豬急性死亡，是養(yǎng)豬業(yè)的一大隱患。該病自2015年傳入我國(guó)后，已在我國(guó)多個(gè)省份暴發(fā)，需引起養(yǎng)豬從業(yè)人員的高度重視。SVA快速診斷方法的建立及SVA疫苗研發(fā)，將有利于SVA防控。SVA感染免疫機(jī)理的研究，將為SVA的防控提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。此外，傳染病的防控還需從加強(qiáng)生物安全體系建設(shè)的角度出發(fā)，將病原攔截在大門外。若是能從大區(qū)域、地區(qū)的角度去建設(shè)生物安全體系，而不僅僅是單個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)自身的生物安全體系建設(shè)，那么，傳染性疾病的防控將上升一個(gè)臺(tái)階。