A型流感病毒M基因的研究進展

喬樹苗，顧 敏,2,3*，劉秀梵,2,3*

(1.揚州大學(xué) 農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點開放實驗室，江蘇 揚州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

1 A型流感概述

流感病毒有4種型：A、B、C和D型，其中感染宿主最多樣并能引起大流行的是A型流感病毒(influenza A virus,IAV)。進一步根據(jù)表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的差異，IAV可被分為18種HA亞型和11種NA亞型。而依據(jù)宿主來源，IAV又可被分為人流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒或其他動物源的流感病毒[1-2]。IAV是分8個節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，每個基因節(jié)段均與三聚體的病毒聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)以及核蛋白(NP)結(jié)合形成病毒核糖核酸蛋白復(fù)合體(vRNP)[3]。已知IAV的基因組可編碼多達17種蛋白，其中由第7節(jié)段M基因所編碼的M蛋白是除HA、NA之外的膜蛋白，包括基質(zhì)蛋白M1(matrix protein 1)、離子通道蛋白M2(ion channel protein)和M42蛋白(M2-null protein)[4-11]。

研究指出，M基因轉(zhuǎn)錄后通過不同剪接方式可產(chǎn)生4個剪接轉(zhuǎn)錄本。M1蛋白由mRNA未經(jīng)剪接的MmRNA1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生；M2蛋白由mRNA選擇性剪接產(chǎn)生的MmRNA2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生；而M42蛋白則由選擇性剪接產(chǎn)生的MmRNA4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，是一種新的M2相關(guān)蛋白，但具有不同于M2的外顯子結(jié)構(gòu)域，其胞外結(jié)構(gòu)域的抗原性也與M2蛋白不同，可以在功能上代償M2蛋白缺陷型病毒中M2蛋白的作用[12-13]。值得注意的是，另外一個剪接轉(zhuǎn)錄本MmRNA3不編碼蛋白，但與MmRNA2具有相同的剪接位點，當(dāng)其遠(yuǎn)剪接位點被聚合酶所阻斷方能啟動MmRNA2的剪接，因此MmRNA3能夠在病毒感染早期充當(dāng)M蛋白表達的負(fù)調(diào)控因子[14-16]。此外，M基因mRNA的剪接調(diào)控還受到發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑中的KH-CB19及其類似物NIH39等剪接調(diào)控因子抑制劑的影響。 ARTARINI等[17]研究發(fā)現(xiàn)在宿主因子中的細(xì)胞分裂周期樣激酶1(CLK1)是M基因mRNA剪接必要的相關(guān)因子，可以與KH-CB19和NIH39進行特異結(jié)合，從而影響M基因的剪接水平并能降低IAV在A549細(xì)胞中的復(fù)制[18-19]。

2 M基因的遺傳進化

根據(jù)IAV的感染宿主差異，M基因可被劃分為7個進化譜系(圖1)，分別為：人譜系Hu1、Hu2，禽譜系A(chǔ)v1、Av2，豬譜系Sw1、Sw2和犬/馬譜系CE[20]。其中，人譜系Hu1，包括1918—1954年的H1N1亞型病毒(西班牙流感及其子代病毒)、1957—1967年的H2N2亞型病毒(亞洲流感及其子代病毒)以及1968年之后的H3N2亞型病毒(香港流感及其子代病毒)；而Hu2主要由1977年以后出現(xiàn)的H1N1亞型病毒(俄羅斯流感)所組成[21-22]。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，Hu1譜系的M基因均從1918大流感病毒衍生而來，雖經(jīng)歷過1957和1968年流感病毒的2次抗原轉(zhuǎn)換，但仍保持著相同的來源；而Hu2譜系M基因盡管最初也來自1918年大流感病毒，但其經(jīng)歷不同的進化過程而形成另一個譜系[22]。禽譜系A(chǔ)v1主要包括來自亞洲的禽流感病毒，Av2則大多來自北美[23]。豬譜系Sw1，位于人和禽譜系之間，主要是北美來源的病毒；而另一個豬譜系Sw2，則從禽譜系A(chǔ)v1分化而來，由1980年后的豬流感病毒所組成，主要來自歐洲[24]。犬/馬譜系CE(圖1)，從Av2分支的根部分化而來，包括H3N8、H3N2、H7N2等亞型的犬流感病毒或馬流感病毒[20,25-26]。通常，上述不同譜系的M基因具有宿主特異性，但豬或禽譜系中的IAV也會導(dǎo)致人感染，例如已知感染人或豬的H5N1亞型病毒均具有禽流感病毒基因組特征，包括禽譜系的M基因[27-28]。

圖1 M基因進化譜系簡圖[20]

研究表明，盡管M1和M2均由IAV的M基因編碼，但兩者在不同宿主體內(nèi)受到的選擇壓力存在差異，表現(xiàn)為獨立進化。 FURUSE等[29]通過對獲取自GenBank 數(shù)據(jù)庫的流感序列進行M基因的進化分析指出，M2受到的選擇壓力要大于M1。 NAGUIB等[30]研究也發(fā)現(xiàn)，禽流感病毒M2承受著大于M1的選擇性壓力；但人流感病毒M1基因所受選擇性壓力又要強于禽流感病毒。祁賢等[31]還指出，M1蛋白的第219位氨基酸在人流感病毒中被鑒定為正選擇位點，而該位點在結(jié)構(gòu)上與T細(xì)胞和MHC細(xì)胞抗原表位有關(guān)。此外， BOGDANOW等[32]研究發(fā)現(xiàn)M基因在禽適應(yīng)株和人適應(yīng)株上具有不同的保守區(qū)，其RNA剪接異構(gòu)體的增加會造成在非適應(yīng)宿主上M1蛋白不能有效地產(chǎn)生，從而影響病毒對宿主的適應(yīng)。并且，CALDERON等[33]研究也發(fā)現(xiàn)M2蛋白會影響IAV在宿主上的適應(yīng)與傳播，M2過度表達使得IAV在非適應(yīng)宿主上的復(fù)制明顯減少。

3 M基因?qū)Σ《拘螒B(tài)的影響

IAV粒子的囊膜具有多形性，主要為球形和絲狀，大小從80～120 nm到幾微米，相關(guān)的試驗證明M1、M2蛋白的關(guān)鍵氨基酸殘基以及M1和M2蛋白間的相互作用可能影響流感病毒的形態(tài)[34-35]。為病毒膜提供結(jié)構(gòu)和支撐的同時，M1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能還決定病毒形成絲狀或球形病毒粒子的能力，M1蛋白在病毒膜下形成螺旋網(wǎng)，但其螺旋轉(zhuǎn)彎的節(jié)距在絲狀和球形病毒粒子中不同。LIU等[36]研究表明A/PR8/1934(H1N1)球形病毒經(jīng)反復(fù)傳代，其絲狀病毒粒子的增加主要與M1蛋白第87,92,101，157位氨基酸的累積突變相關(guān)，通過建模發(fā)現(xiàn)這些殘基均位于M1二聚體帶正電荷的表面。 LIU等[37]還發(fā)現(xiàn)M2蛋白胞質(zhì)尾區(qū)第76位酪氨酸到丙氨酸的突變(Y76A)會減少感染性病毒顆粒的產(chǎn)生和細(xì)絲狀病毒粒子的形成。由于M2蛋白的尾部在與M1結(jié)合的過程中具有重要作用，因此M2尾部基因的突變也會改變M1蛋白對絲狀病毒粒子形成的影響[38]。

4 基質(zhì)蛋白M1

作為IAV包膜的主要成分，基質(zhì)蛋白M1在流感病毒生命周期的多個階段均起著重要的調(diào)控作用，包括脫衣殼、轉(zhuǎn)錄、vRNP的核輸出、組裝和萌發(fā)[39]。

M1是IAV顆粒中含量最多的蛋白，位于病毒膜內(nèi)層；pH為4時以二聚體形式存在，pH為7.4時則以多聚體形式存在[40]。M1基因序列高度保守，由252個氨基酸組成，顯微鏡下呈現(xiàn)1個球形N端結(jié)構(gòu)域和1個靈活的C端延伸部分[41-43]。N端結(jié)構(gòu)域由分別位于2～67和91～158位氨基酸，2個四螺旋束經(jīng)1個螺旋結(jié)構(gòu)連接而成，88～164位氨基酸構(gòu)成的中間結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)M1的寡聚并連接vRNP和病毒包膜，C端結(jié)構(gòu)域則由165～252位氨基酸折疊成螺旋并包含一個明顯的非結(jié)構(gòu)化區(qū)域[44-46]。

IAV子代病毒在細(xì)胞膜萌發(fā)的過程中，新復(fù)制的vRNP需要穿過核膜到達細(xì)胞質(zhì)，才能與內(nèi)小體一起沿著微管運輸?shù)讲《境鲅奎c[47]。然而，病毒出芽部位的HA和NA簇位于質(zhì)膜上，HA蛋白雖能啟動病毒復(fù)制但卻無法完成病毒萌發(fā)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，M1可能與HA和NA的細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)域發(fā)生相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜彎曲而協(xié)助病毒脫衣殼[47-49]。M1既介導(dǎo)對HA誘導(dǎo)病毒出芽的限制，也介導(dǎo)出芽過程所需其他病毒蛋白的招募。M1蛋白能夠在病毒復(fù)制時直接結(jié)合vRNP和核輸出蛋白NEP，形成包含有2個核輸出信號(NESs)的核輸出復(fù)合體，同時將vRNP從細(xì)胞核運送到細(xì)胞質(zhì)并輔助vRNP組裝成病毒顆粒[50-51]。另外，M1還可通過與多種宿主細(xì)胞因子互作來調(diào)控流感病毒的復(fù)制，如WATANABE 等[52]研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白HSC70與M1的結(jié)合能夠抑制M1和NP的核輸出，進而抑制病毒復(fù)制并影響到病毒的毒力和致病性。

5 離子通道蛋白M2

離子通道蛋白M2是一種具有離子通道活性的跨膜蛋白，在病毒粒子進入宿主細(xì)胞、組裝、萌發(fā)中起重要作用。M2離子通道活性不僅是病毒復(fù)制所必須的，而且通過多種途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，同時也是離子通道抑制劑型抗流感藥物如金剛烷胺、金剛乙胺等的靶點[53-54]。

M2是一種單通道Ⅲ型膜蛋白，錨定于病毒包膜中，由二硫鍵連接的一對二聚體或四聚體所組成，包含97個氨基酸(M基因第26～51位和第740～1 007 位核苷酸編碼)[42,53]。結(jié)構(gòu)上，M2蛋白依次分為胞外區(qū)N-末端胞外結(jié)構(gòu)域(ED，1～24位氨基酸)、中間跨膜區(qū)(TMD，25～43位氨基酸)、胞內(nèi)區(qū)和C-末端結(jié)構(gòu)域(CTD，44～97位氨基酸)，其中CTD又由兩親性螺旋(APH，45～62位氨基酸)和細(xì)胞質(zhì)尾部(CT，63～97位氨基酸)所組成[56-59]。

5.1 M2蛋白的離子通道活性M2蛋白形成的質(zhì)子選擇性離子通道受細(xì)胞環(huán)境pH調(diào)節(jié)，當(dāng)酸性環(huán)境pH值較低時該通道被激活，在vRNP釋放到宿主細(xì)胞胞質(zhì)的過程中起重要作用。病毒在受體介導(dǎo)內(nèi)吞、入侵宿主細(xì)胞時，內(nèi)小體質(zhì)膜pH降低，運輸囊泡將新合成的病毒包膜蛋白(包括M2、HA、NA蛋白)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸至高爾基體，最終到達細(xì)胞膜。通過高爾基體時，離子通道形成的酸性環(huán)境將經(jīng)由溶酶體或者蛋白酶體降解途徑來促進轉(zhuǎn)運蛋白的降解，使得胞質(zhì)中vRNP釋放轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中，幫助病毒脫殼和釋放[60-61]。此外，M2蛋白能夠阻止LC3II蛋白與自噬體結(jié)合從而干擾細(xì)胞自噬，參與病毒在細(xì)胞內(nèi)的脫膜過程[38,47,57]。 BEALE等[62]研究發(fā)現(xiàn)，M2胞質(zhì)尾區(qū)不僅含有一個從胞膜出芽所必需的α-螺旋區(qū)(45～61位氨基酸)，還包含與膽固醇識別及互作密切相關(guān)的氨基酸共識(CRAC)區(qū)域和一個與LC3互作的區(qū)域(91～94位氨基酸)，該區(qū)域的存在能夠破壞自噬、維持病毒粒子穩(wěn)定性。

5.2 M2蛋白與宿主蛋白的相互作用M2蛋白在進入細(xì)胞膜的過程中，其胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)直接接觸細(xì)胞質(zhì)，與細(xì)胞蛋白存在相互作用。M2蛋白可以通過調(diào)節(jié)pH水平影響細(xì)胞其他蛋白的表達，其胞外區(qū)被宿主的免疫系統(tǒng)識別后可干擾宿主蛋白并引起宿主細(xì)胞炎性因子激活和功能紊亂。TAKESHI等[63]研究表明，M2蛋白的離子通道活性是流感病毒激活單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的炎癥小體所必需的。GUAN等[64]研究發(fā)現(xiàn)NS1/M2介導(dǎo)的PKR通路有助于流感病毒的復(fù)制與釋放，協(xié)同熱休克蛋白Hsp-p58活化PKR通路，促使細(xì)胞死亡以及病毒釋放[65]。

6 總結(jié)

預(yù)防流感的有效方法之一是使用疫苗，然而現(xiàn)有的疫苗設(shè)計多聚焦于HA和NA蛋白所提供的免疫保護作用，但由于這兩種表面糖蛋白的抗原性變異，需要定期地對疫苗株進行更新以確保其與流行株具有良好的抗原匹配，因此研發(fā)抗病毒藥物以尋求更廣泛或更“普遍”的抗病毒作用也顯得至關(guān)重要。目前，M2離子通道阻滯劑和NA抑制劑是已投入臨床使用的兩種主要的抗流感藥物；而相較于NA，M2蛋白的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，其抑制劑類藥物也相對更為廣譜。另外，基質(zhì)蛋白M1在流感病毒的生命周期中，尤其是病毒出芽過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，進一步研究M1和M2蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、宿主蛋白所介導(dǎo)M2蛋白在諸如vRNP釋放和萌芽等過程的作用，有助于深入理解M基因在流感病毒感染與致病中的相關(guān)機理，并靶向M基因開發(fā)具有跨亞型保護效果的通用性疫苗或針對IAV復(fù)制周期特定階段的新型抗病毒藥物，從而有效應(yīng)對新型重組IAV、耐藥性IAV的出現(xiàn)及其潛在風(fēng)險。