子宮內(nèi)膜炎奶牛血酮與炎性細(xì)胞因子的相關(guān)性

張瑞雪， 張 博， 趙 輝， 趙 謎， 郭延生

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

子宮內(nèi)膜炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中最常見(jiàn)的產(chǎn)后疾病，易引起產(chǎn)奶量和繁殖力下降。引發(fā)奶牛子宮內(nèi)膜炎最普遍因素是細(xì)菌感染[1-2]，這些細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌等。當(dāng)大量細(xì)菌入侵奶牛子宮時(shí)，抗原刺激免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等)和非免疫細(xì)胞(表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等)合成并分泌細(xì)胞因子，從而激活局部非特異性和特異性的細(xì)胞、體液免疫機(jī)制，清除子宮內(nèi)感染的細(xì)菌等有害物質(zhì)。但奶牛產(chǎn)后干物質(zhì)采食量下降，能量輸出增加，易導(dǎo)致能量負(fù)平衡，奶牛免疫力減弱，引起子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生。研究表明，奶牛臨床或亞臨床子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生與子宮組織中炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)有極大的關(guān)聯(lián)[3-4]，子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中大多數(shù)炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著升高[5-6]。為更全面評(píng)價(jià)炎性細(xì)胞因子在奶牛子宮內(nèi)膜炎炎癥中的變化規(guī)律及其與能量負(fù)平衡之間相關(guān)性，本研究對(duì)產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎奶牛血酮與血漿中炎性細(xì)胞因子的變化及其相關(guān)性進(jìn)行研究，以期為子宮內(nèi)膜炎的診斷和治療提供更詳細(xì)的資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)、白細(xì)胞介素-23(IL-23)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司；Nova Vet血酮(BHBA)檢測(cè)試紙(哈羅德，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與樣品制備本試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為荷斯坦奶牛。從寧夏賀蘭中地生態(tài)牧場(chǎng)一場(chǎng)隨機(jī)選取8頭2～3胎次產(chǎn)后0～21 d患有子宮內(nèi)膜炎奶牛和8頭2～3胎次產(chǎn)后0～21 d健康奶牛,尾靜脈采血，裝入抗凝管，制備血漿，—80℃保存。

1.3 血液中細(xì)胞因子的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定血漿中促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、IL-23和抗炎性細(xì)胞因子TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13的質(zhì)量濃度,所有試驗(yàn)步驟均按照試劑盒所帶說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行。

1.4 血酮值的測(cè)定用血酮檢測(cè)試紙測(cè)量血酮值(KET,ketone bodies)，并記錄。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿中促炎性細(xì)胞因子的變化規(guī)律ELISA檢測(cè)子宮內(nèi)膜炎奶牛和健康奶牛血漿中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量，結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜炎組血漿中促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-17和IL-18的含量顯著升高(P<0.05)，而IL-23的含量無(wú)明顯變化(P>0.05)(表1)。

表1 子宮內(nèi)膜炎組和對(duì)照組血漿中促炎性細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果 ng/L

2.2 子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿中抗炎性細(xì)胞因子的變化規(guī)律ELISA檢測(cè)子宮內(nèi)膜炎奶牛和健康奶牛血漿中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量,結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜炎組血漿中抗炎性細(xì)胞因子TGF-β、IL-4和IL-10的含量與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)，而IL-13的含量無(wú)明顯變化(P>0.05)(表2)。

表2 子宮內(nèi)膜炎組和對(duì)照組血漿中促炎性細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果 ng/L

2.3 奶牛產(chǎn)后炎性細(xì)胞因子和酮體相關(guān)性分析

2.3.1奶牛產(chǎn)后試驗(yàn)組和對(duì)照組血酮值變化 圖1中四分位數(shù)為箱型方框的上、下邊，以最大值(max)、最小值(min)為線的上、下端，箱型方框中的線為中位數(shù)(median)的位置。子宮內(nèi)膜炎組奶牛的最大血酮值(mmol/L)約為3.5,上四分位數(shù)約為2.8,中位數(shù)約為1.5，下四分位數(shù)約為1.1,最小血酮值約為0.5(對(duì)照組);而對(duì)照組的最大血酮值(mmol/L)約為1.5,上四分位數(shù)約為1.2,中位數(shù)約為0.8,下四分位數(shù)約為0.5,最小血酮值約為0.2(子宮內(nèi)膜炎組);說(shuō)明子宮內(nèi)膜炎組奶牛的血酮值顯著升高(P<0.05)。

2.3.2炎性細(xì)胞因子和酮體相關(guān)性分析 子宮內(nèi)膜炎奶牛KET與促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-8、IL-18的相關(guān)系數(shù)分別為0.786，0.833，0.810，0.881，與抗炎性細(xì)胞因子TGF-β、IL-4、IL-10的相關(guān)系數(shù)分別為0.738，0.738，0.714。KET與TNF-α、IL-1、IL-8水平之間呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)，與IL-18水平之間呈極顯著性正相關(guān)(P<0.01)，KET與TGF-β、IL-4、IL-10水平之間呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)(表3)。

注：**代表極顯著性差異(P<0.01)

3 討論

3.1 子宮內(nèi)膜炎奶牛促炎性細(xì)胞因子含量變化奶牛子宮在正常情況下受生理屏障和防御機(jī)能的保護(hù)，處于無(wú)菌健康狀態(tài)。即使有細(xì)菌入侵，子宮會(huì)逐漸將其凈化，在一定的時(shí)間內(nèi)復(fù)舊。奶牛分娩后，子宮頸擴(kuò)張，細(xì)菌易通過(guò)外陰、生殖道和開(kāi)張的子宮頸入侵子宮，而且奶牛產(chǎn)后初期子宮內(nèi)的環(huán)境和溫度有利于細(xì)菌的繁殖，產(chǎn)后初期奶牛子宮內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生一定程度的炎癥。但是，奶牛的子宮復(fù)舊機(jī)能能夠在產(chǎn)后21 d之內(nèi)，清除子宮內(nèi)感染的細(xì)菌等有害物，使其恢復(fù)健康狀態(tài)。然而，體質(zhì)差、免疫機(jī)能弱的奶牛，細(xì)菌在其體內(nèi)大量繁殖，造成子宮內(nèi)膜損傷，引發(fā)子宮內(nèi)膜炎等疾病。子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率高達(dá)20%～40%[7]。造成子宮內(nèi)膜炎的可能原因是奶牛分娩后初期泌乳增加、干物質(zhì)采食量不足等，導(dǎo)致奶牛的免疫力下降，大量的細(xì)菌入侵子宮并繁殖。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿中TNF-α的表達(dá)水平明顯升高。TNF-α是一種可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞分泌的致炎因子，是奶牛子宮內(nèi)膜炎的診斷標(biāo)志物之一[8]。TNF-α能增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等各種細(xì)胞中IL-6合成而具有繼發(fā)性炎癥作用，并且可能調(diào)節(jié)免疫、炎性或修復(fù)性反應(yīng)[8]。另外，當(dāng)TNF-α的表達(dá)量過(guò)高時(shí)，可直接作用于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致子宮產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[9]。

同時(shí)，高水平的TNF-α能夠增加細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)IL-1、IL-6、IL-8的產(chǎn)生，加重奶牛子宮內(nèi)膜炎炎癥[10]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜炎組血漿中IL-1、IL-6、IL-8的質(zhì)量濃度顯著升高。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中IL-1的表達(dá)水平顯著升高[10]，IL-6[11]和IL-8[9]的表達(dá)水平也有升高趨勢(shì)。IL-1質(zhì)量濃度增加，可能由于奶牛子宮炎癥持續(xù)的過(guò)程中，抗原刺激巨噬細(xì)胞分泌大量的IL-1，誘導(dǎo)IL-6、IL-8、TNF-α和趨化因子表達(dá)，以達(dá)到促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用。作為中性粒細(xì)胞的趨化劑，高質(zhì)量濃度的IL-8能夠趨化嗜中性粒細(xì)胞及炎性細(xì)胞等向病灶部位游走、積聚，以清除炎癥部位的細(xì)菌、壞死組織和損傷的細(xì)胞，從而促進(jìn)奶牛子宮內(nèi)膜炎炎癥的發(fā)展，增強(qiáng)和放大炎癥反應(yīng)，引起機(jī)體局部免疫反應(yīng)[2]。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜炎奶牛組血漿中IL-6的質(zhì)量濃度顯著高于對(duì)照組。有研究證實(shí)奶牛子宮內(nèi)膜炎通常會(huì)導(dǎo)致TNF-α和IL-6等促炎性細(xì)胞因子含量增加[9]。IL-6 mRNA的表達(dá)不受子宮炎癥的影響[12]，當(dāng)奶牛受到病毒或其他一些促炎因子(IL-1、TNF-α)的刺激時(shí)，局部免疫系統(tǒng)的細(xì)胞才會(huì)產(chǎn)生IL-6[13]。高質(zhì)量濃度的IL-6能夠促進(jìn)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生更多的抗體。子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮中存在病原微生物，將會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞)數(shù)量增加[14]。本試驗(yàn)中子宮內(nèi)膜炎奶牛血液中促炎性細(xì)胞因子IL-6水平升高。然而，有相關(guān)研究表明，血清中IL-6含量在子宮內(nèi)膜炎奶牛和健康奶牛之間沒(méi)有差異性[15]，推測(cè)是病原微生物刺激子宮產(chǎn)生的白細(xì)胞和隨血液一起流入的白細(xì)胞分泌IL-6，導(dǎo)致子宮沖洗液中IL-6質(zhì)量濃度顯著性升高。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于IL-17的研究集中在皮癬、炎性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎的治療方面[16]，尚未發(fā)現(xiàn)奶牛子宮內(nèi)膜炎方面的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜炎組血漿中IL-17的質(zhì)量濃度顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)，患有慢性子宮內(nèi)膜炎的人，IL-17質(zhì)量濃度明顯升高[17]。同時(shí)，乳腺炎奶牛IL-17的表達(dá)量也顯著性升高[18]。IL-17過(guò)度表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中趨化因子的產(chǎn)生和白細(xì)胞浸潤(rùn)[19]，介導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜炎的炎癥反應(yīng)。

3.2 子宮內(nèi)膜炎奶?？寡仔约?xì)胞因子含量變化研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜炎奶牛的血清中IL-10的表達(dá)水平有顯著升高趨勢(shì)，子宮內(nèi)膜異位癥婦女的血清中TGF-β、IL-10表達(dá)水平顯著升高[10,20]，同時(shí)，豬子宮內(nèi)膜炎中IL-4、IL-10表達(dá)量顯著升高[21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿中抗炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-13和TGF-β的質(zhì)量濃度顯著升高。CD8+淋巴細(xì)胞釋放增加，在奶牛子宮內(nèi)膜炎炎癥持續(xù)的過(guò)程中，發(fā)揮其抑制功能，抑制炎癥反應(yīng)[13]。本研究中IL-10表達(dá)水平升高可能與CD8+淋巴細(xì)胞釋放增加相關(guān)。高質(zhì)量濃度的IL-10通過(guò)抑制T細(xì)胞的增殖使局部細(xì)胞的免疫能力下降，抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜組織的保護(hù)作用，此時(shí)，子宮局部抵抗細(xì)菌等感染的能力減弱，微生物無(wú)法被完全清除而損壞奶牛子宮內(nèi)膜組織，從而使奶牛子宮內(nèi)膜炎持續(xù)存在。目前，IL-4和IL-13在動(dòng)物子宮內(nèi)膜炎等方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)IL-4和IL-13表達(dá)水平升高，其可能原因是細(xì)菌等病原微生物入侵子宮，造成局部感染，體液免疫和細(xì)胞免疫被激活，而T輔助細(xì)胞(TH)的活化和增殖是特異性免疫產(chǎn)生的關(guān)鍵，活化的TH細(xì)胞分泌大量IL-4和IL-13。高質(zhì)量濃度的TGF-β可能通過(guò)誘導(dǎo)免疫球蛋白IgA分泌并促進(jìn)組織修復(fù)來(lái)發(fā)揮抗炎作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿中IL-13、IL-18和IL-23的質(zhì)量濃度與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。已知IL-13是一種多功能的Th2型細(xì)胞因子，它可以減輕炎癥反應(yīng)，但其與奶牛子宮內(nèi)膜炎的相關(guān)性有待研究。國(guó)內(nèi)外關(guān)于IL-13的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，IL-13能夠增強(qiáng)病灶周?chē)鷧^(qū)域受損神經(jīng)元的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬作用，以改善神經(jīng)炎癥和促進(jìn)腦功能的恢復(fù)[22]。奶牛被分枝桿菌感染時(shí)，促炎性細(xì)胞因子IL-18水平顯著升高，導(dǎo)致免疫反應(yīng)增強(qiáng)[23]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于細(xì)胞因子IL-23的最新研究，都體現(xiàn)在其對(duì)包括關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的炎性疾病進(jìn)展的影響，通常與T淋巴細(xì)胞的生物學(xué)有關(guān)[24]。

3.3 子宮內(nèi)膜炎奶牛炎性細(xì)胞因子與酮體相關(guān)性分析圍產(chǎn)期奶牛由于飼糧、管理和環(huán)境等改變，能量需要和生產(chǎn)需求增加，干物質(zhì)采食量下降，導(dǎo)致奶牛能量負(fù)平衡(negative energy balance,NEB)。奶牛產(chǎn)后子宮易受微生物感染，引發(fā)子宮炎癥。長(zhǎng)期NEB導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生大量酮體，引起酮病，使奶牛體質(zhì)下降和子宮的免疫力減弱而引起子宮復(fù)舊機(jī)能顯著下降[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，NEB與奶牛產(chǎn)后疾病具有很大的相關(guān)性，NEB使臨床型子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率顯著增加[26]。本研究中，子宮內(nèi)膜炎組奶牛的血酮值顯著升高，KET與TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-4、IL-8、IL-10水平之間呈顯著性正相關(guān)，與IL-18水平之間呈極顯著性正相關(guān)，表明奶牛產(chǎn)后能量負(fù)平衡能顯著降低奶牛的免疫水平，進(jìn)而誘發(fā)子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生。

本研究采用Nova Vet血酮儀和ELISA法對(duì)子宮內(nèi)膜炎奶牛血液中的KET與炎性細(xì)胞因子進(jìn)行了測(cè)定和相關(guān)性分析，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜炎奶牛KET、TNF-α、TGF-β、IgG、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17及IL-18的水平顯著升高，KET與TNF-α、IL-1、IL-8、TGF-β、IL-4、IL-10和IL-18之間呈顯著性或極顯著性正相關(guān)，說(shuō)明奶牛產(chǎn)后能量負(fù)平衡可顯著降低其免疫水平，是子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的因素之一。