淺綠色氣球菌噬菌體vB_AviM_AVP編碼蛋白的表達(dá)純化和功能分析

張 昊，襲恒豫，畢斕婷，趙日虹，冀亞路，王心舞，王子晶，顧敬敏，韓文瑜

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

淺綠色氣球菌 (Aeroeoccusviridans)是過(guò)氧化氫酶和氧化酶陰性、微需氧性和非運(yùn)動(dòng)性細(xì)菌，一種革蘭陽(yáng)性球菌[1]，廣泛分布在環(huán)境中，由于其形態(tài)與鏈球菌很相似且常引起混合感染，故二者?；煜齕2]。淺綠色氣球菌雖然不是一種常見(jiàn)的病原菌，但卻是潛在的機(jī)會(huì)病原菌，當(dāng)機(jī)體免疫力下降或免疫功能不健全時(shí)，可以引起人類心內(nèi)膜炎、敗血癥、菌血癥以及關(guān)節(jié)炎等[3]；在獸醫(yī)臨床上，可引起豬的腦膜炎、肺炎、尿路感染和關(guān)節(jié)炎，牛臨床和亞臨床乳腺炎等。目前，治療由淺綠色氣球菌引起的感染仍以抗生素為主。但近期研究表明，新分離的淺綠色氣球菌具有多重耐藥性[4]，尋找新的治療方法已經(jīng)迫在眉睫。

噬菌體是一種能夠特異性識(shí)別、感染和復(fù)制宿主細(xì)菌的細(xì)菌病毒[5-6]，由于其具有特定的殺菌能力，在20世紀(jì)20年代早期，噬菌體一直被認(rèn)為是治療性的藥物[7]。然而，由于抗生素的廣泛應(yīng)用，這種治療方法被擱淺[8]。近年來(lái)，由于多重耐藥細(xì)菌在全球多地廣泛出現(xiàn)，以噬菌體為治療的方法得到了廣泛關(guān)注，裂解酶的應(yīng)用也得到了推廣。本研究根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的淺綠色氣球菌噬菌體vB_AviM_AVP的基因組[9]，對(duì)LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98進(jìn)行原核表達(dá)與純化，并對(duì)其活性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒淺綠色氣球菌AV-X1、N14-1，金黃色葡萄球菌R196、鏈球菌SS42、 Pet-15b由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α、BL21感受態(tài)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要試劑BHI培養(yǎng)基、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)；XhoⅠ、BamHⅠ(TaKaRa)；T4DNA連接酶(NEB)；氨芐青霉素、咪唑、IPTG(Sigma)；Tris-base、SDS、甘氨酸、過(guò)硫酸銨(Amresco)；Ni-NTA(GE)、蛋白Marker(Thermo)；超濾管(Millipore)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)。

1.3 引物引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.4 裂解酶載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)與純化

1.4.1載體的構(gòu)建 以vB_AviM_AVP的基因組作為模板，用表1的引物通過(guò)PCR獲得目的基因；選取適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶對(duì)目的基因和載體進(jìn)行雙酶切；將酶切后的載體和目的片段按照1∶5的比例混合連接，先轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中。

1.4.2誘導(dǎo)與表達(dá) 挑取Amp+平板上的單菌落培養(yǎng)10 h，轉(zhuǎn)接入500 mL LB培養(yǎng)基中，按照1%的比例加入Amp+進(jìn)行大量擴(kuò)增。當(dāng)菌液生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)(D600= 0.6～0.8)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16℃低溫誘導(dǎo)16 h。4℃、8 000 r/min離心10 min后棄上清，用50 mL Tris-NaCl溶液將菌體重懸。

1.4.3純化 將收集的菌體置于冰上，超聲30 min，破碎菌體。4℃、12 000 r/min離心20 min后收集上清。將超聲上清加入Ni-NTA柱子中，并將填料重懸，使得蛋白能與填料充分結(jié)合。靜置3 min 后，使上清液自然流出。用Tris-NaCl溶液將濃度為5 mol/L的咪唑分別稀釋至終濃度為20，50，500 mmol/L。其中20，50 mmol/L的咪唑各50 mL洗滌雜蛋白，500 mmol/L的咪唑10 mL洗脫目的蛋白。通過(guò)超濾管以4℃、3 500 r/min離心30 min對(duì)純化后的裂解酶進(jìn)行濃縮。

1.5 LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysOR-F98的活性檢測(cè)將淺綠色氣球菌AV-X1、NP-1，金黃色葡萄球菌R196、鏈球菌SS42活化，取100 μL 的菌液涂布在平板上，分別取10 μL的超聲上清和純化后的LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98蛋白，培養(yǎng)過(guò)夜，觀察是否有空斑出現(xiàn)。

1.6 酶譜試驗(yàn)用500 mL BHI 擴(kuò)增淺綠色氣球菌AV-X1、金黃色葡萄球菌R196、鏈球菌SS42，擴(kuò)增5 h后離心，ddH2O洗滌3次，用5 mL的ddH2O將菌體重懸后高壓，于-20℃保存?zhèn)溆?。配置SDS-PAGE分離膠，加入高壓后的菌液，使膠呈半透明狀態(tài)。樣片加入Loading Buffer后進(jìn)行跑膠，電泳結(jié)束后將膠置于復(fù)性劑中(50 mmol/L Tris,1% TristoX-100,pH 7.4)，脫色搖床慢搖2 h復(fù)性。

1.7 高碘酸鹽以及蛋白酶K處理菌體試驗(yàn)先將淺綠色氣球菌AV-X1、金黃色葡萄球菌R196、鏈球菌SS42的菌液離心，棄掉上清，用無(wú)菌的PBS洗3次，加入等體積pH 5.2的50 mmol/L乙酸鈉。分為4組，對(duì)照組，直接加入蛋白(50 mg/L)組，加入100 mmol/L高碘酸 25℃避光處理2 h組，加入蛋白酶K 10 μL處理3 h組。將后2組處理后的樣品用無(wú)菌PBS洗5次，再分別加入蛋白(50 mg/L)，測(cè)30，60，90，120 min以及12 h的D600值。

1.8 混合蛋白活性檢測(cè)將淺綠色氣球菌搖至D600值為0.8左右，用無(wú)菌的PBS洗3次后，用等體積的PBS重懸，分為4組，分別為空白對(duì)照組、混合蛋白組(LysORF86、LysORF94、LysORF90、LysORF98以相同濃度混合入1 mL體系中)、混合蛋白+裂解酶組(LysORF86、LysORF94、LysORF90、LysORF98、裂解酶以相同濃度混合入1 mL體系中)、裂解酶組。測(cè)30，60，90，120 min以及12 h的D600值。

2 結(jié)果

2.1 LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysOR-F98的原核表達(dá)與純化蛋白純化結(jié)果如圖1，2，3所示，結(jié)果表明LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98均得到表達(dá)，且表達(dá)形式為可溶性，純化后分別得到了大小約為73.7，38.2，112.0，20.4 kDa蛋白。

M.蛋白Marker；1.誘導(dǎo)后的全菌；2.超聲后的上清;3.超聲后的沉淀;4.純化后的LysORF86;5.誘導(dǎo)后的全菌;6.超聲后的上清;7.超聲后的沉淀;8.純化后的LysORF94

2.3 Lys-AVP-02、Lys-AVP-05、Lys-AVP-07和Lys-AVP-08的活性檢測(cè)平板涂布滴板結(jié)果表明，LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98均沒(méi)有活性(圖4，5)。

2.4 酶譜試驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋白LysORF86對(duì)AV-X1、SS42表現(xiàn)出活性(圖6，7)，蛋白LysORF90對(duì)AV-X1表現(xiàn)出活性(圖8)，蛋白LysORF94對(duì)R196表現(xiàn)出活性(圖9)，蛋白LysORF98對(duì)AV-X1無(wú)活性(圖10)。

M.蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)的菌液；2.誘導(dǎo)后的全菌；3.超聲后的上清；4.超聲后的沉淀；5.純化后的LysORF90

M.蛋白Marker;1.未誘導(dǎo)的菌液;2.誘導(dǎo)后的全菌;3.超聲后的上清;4.純化后的LysORF98

A:AV.淺綠色氣球菌AV-X1;NP-1.淺綠色氣球菌NP-1;上清.LysORF90超聲后的上清;純化.純化后的LysORF90。B：R196.金黃色葡萄球菌R196;SS42.鏈球菌SS42;上清.LysORF90超聲后的上清;純化.純化后的LysORF90

A：AV.淺綠色氣球菌AV-X1;NP-1.淺綠色氣球菌NP-1;上清.LysORF98超聲后的上清;純化.純化后的LysORF98。B：R196.金黃色葡萄球菌R196;SS42.鏈球菌SS42;上清.LysORF98超聲后的上清;純化.純化后的LysORF98

M.蛋白Marker;1.ORF86;2.ORF94

M.蛋白Marker;1.ORF80;2.ORF94

2.5 高碘酸鹽以及蛋白酶K處理菌體試驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋白LysORF86對(duì)AV-X1和SS42表現(xiàn)出極弱的殺菌活性(圖11，12)，lysORF94對(duì)R196未表現(xiàn)出殺菌活性(圖13)。

M.蛋白Marker;1.ORF86;2.ORF90

M.蛋白Marker;1.ORF86;2.ORF94

2.6 混合蛋白活性檢測(cè)結(jié)果如表2所示，30 min時(shí)混合蛋白可以引起D600值下降，與裂解酶混合后的蛋白或者單一的裂解酶D600值顯著降低，超過(guò)30 min后，單獨(dú)的混合蛋白基本沒(méi)有影響，而與裂解酶混合后會(huì)引起D600值降低，但是主要因素仍取決于裂解酶。

M.蛋白Marker;1.ORF98

圖11 LysORF86對(duì)處理后AV-X1的作用

圖12 LysORF86對(duì)處理后SS42的作用

3 討論

淺綠色氣球菌是一種人畜共患條件性致病菌,廣泛分布于咸肉、空氣中，但臨床上已出現(xiàn)越來(lái)越多的人和動(dòng)物感染淺綠色氣球菌的病例[10]。近年來(lái)，已有研究表明淺綠色氣球菌對(duì)最常見(jiàn)的抗生素越來(lái)越耐藥[11]，已出現(xiàn)萬(wàn)古霉素耐藥分離株[12],意味著在超級(jí)耐藥菌出現(xiàn)之前，尋找新的抗菌方法已經(jīng)迫在眉睫。

圖13 LysORF94對(duì)處理后R196的作用

表2 混合蛋白活性檢測(cè)D600值

噬菌體可以特異性的感染并殺死細(xì)菌，因此可以利用噬菌體對(duì)患者體內(nèi)感染的細(xì)菌進(jìn)行特異性清除。噬菌體種類繁多，在自然界中廣泛分布，是天然的資源[13]。目前，國(guó)內(nèi)外有許多成功利用噬菌體治愈患者超級(jí)耐藥細(xì)菌感染的報(bào)道[14]。噬菌體裂解酶在噬菌體感染并裂解宿主菌的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,而裂解酶作為一種蛋白質(zhì)，可以通過(guò)基因工程的方法大量獲得。這些都表明噬菌體及其裂解酶在替代傳統(tǒng)抗生素療法中具有很好的應(yīng)用前景。

本研究通過(guò)對(duì)淺綠色氣球菌噬菌體vB_AviM_AVP的全基因組分析、預(yù)測(cè)，并通過(guò)原核表達(dá)的方法，成功獲得了LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98；通過(guò)平板涂布滴板試驗(yàn)，表明LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98不具有殺菌活性，這種情況在葛懷娜等[15]噬菌體的裂解酶表達(dá)過(guò)程中也出現(xiàn)過(guò)，可能是因?yàn)榈鞍椎幕钚圆粡?qiáng)，不能穿透細(xì)菌的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，因此本研究首先進(jìn)行酶譜試驗(yàn)，驗(yàn)證LysORF86對(duì)AV-X1、SS42，LysORF90對(duì)AV-X1，LysORF94對(duì)R196表現(xiàn)出活性，LysORF98對(duì)AV-X1無(wú)活性；根據(jù)酶譜活性結(jié)果，進(jìn)一步參照CAI等[16]的方法，利用高碘酸以及蛋白酶K處理菌體試驗(yàn)檢測(cè)是否菌體本身影響了蛋白的效果。結(jié)果表明，菌體表面的多糖和蛋白可能對(duì)蛋白活性存在影響，但并不是主要因素；最后推測(cè)蛋白是有功效的，就像噬菌體可以裂解該細(xì)菌并非是單獨(dú)的蛋白就可以裂解，需要多個(gè)蛋白及其他物質(zhì)的參與，所以推斷，是否混合后的蛋白就可以起到殺菌作用，或與其裂解酶合用能夠增強(qiáng)殺菌能力。本研究通過(guò)測(cè)量D600值檢測(cè)到混合后的蛋白，在30 min時(shí)可以略降低D600值，與裂解酶混合后功效也會(huì)略有增加，但是并沒(méi)有引起顯著變化。超過(guò)30 min后，單獨(dú)的混合蛋白基本沒(méi)有影響，而與裂解酶混合后還是會(huì)引起D600值降低，但是主要因素仍取決于裂解酶，這些結(jié)果表明，已經(jīng)表達(dá)的蛋白功效尚待進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。