綿羊源溶血性曼氏桿菌的分離、鑒定及其生物學(xué)特性分析

郜 敏，楊有文，楊發(fā)龍

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，MH)屬于巴氏桿菌科曼氏桿菌屬，為一種革蘭陰性球桿菌。該病原是一種條件致病菌，常存在于反芻動(dòng)物的上呼吸道中，當(dāng)宿主因運(yùn)輸、環(huán)境變化等造成應(yīng)激以及支原體或病毒感染而導(dǎo)致抵抗力下降時(shí)，即可侵襲宿主肺部引起嚴(yán)重的呼吸道疾病[1]。MH被認(rèn)為是引起牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)的主要病原[2]。但近年來國內(nèi)外的研究已表明，MH同時(shí)也是引起綿羊、山羊肺炎及其他野生小反芻動(dòng)物肺炎的重要病原[3-4]。此外，該病原可導(dǎo)致羔羊的敗血癥和綿羊乳房炎等疾病。目前，由MH引起的疾病在全球范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。

近年來，我國養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展迅速，并迅速從傳統(tǒng)放養(yǎng)向規(guī)?；︷B(yǎng)發(fā)展，但由于飼養(yǎng)環(huán)境變化以及管理不當(dāng)?shù)仍?，呼吸道疾病頻發(fā)，給養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展帶來威脅。其中，由MH引起的綿羊及山羊肺炎的病例屢見報(bào)道[7-8]，但目前對于臨床分離菌株的血清型及其他生物學(xué)特征研究甚少。

2018年以來，四川省涼山州某綿羊場持續(xù)發(fā)生以咳嗽、呼吸急促、流涕為特征的呼吸道傳染病。為調(diào)查病原，本實(shí)驗(yàn)室通過特異性PCR對多種病原的感染情況進(jìn)行分子檢測，發(fā)現(xiàn)患病動(dòng)物中MH感染極為普遍，是引起該羊場發(fā)生呼吸道疾病的主要病原。由于目前對綿羊源MH的生物等特征了解較少，本研究從該羊場分離MH，并對其血清學(xué)、藥物敏感性及毒力因子等分子生物學(xué)特征進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑全血瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；馬血清購自鄭州佰安生物工程有限公司；PCR-Mix和DNA Marker 等均購自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司；藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株(大腸桿菌 ATCC25922)由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 MH的分離從40只表現(xiàn)有咳嗽、流涕、呼吸困難等明顯呼吸道癥狀的患羊鼻腔深部采集棉拭子，接種于全血瓊脂平板。

將40個(gè)全血瓊脂平板放置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h，挑取疑似單菌落劃線接種于含5%馬血清的TSA培養(yǎng)基中進(jìn)行純化。挑取純化后的單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。挑取純化的單菌落接種于2 mL含5%馬血清的TSB培養(yǎng)液中進(jìn)行增菌，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)18 h。純化后的增菌液用于基因組DNA提取以及PCR檢測。

1.3 分離菌株基因組DNA提取及特異性PCR鑒定對疑似菌株進(jìn)行純培養(yǎng)后，用酚-氯仿方法提取基因組DNA，并以其為模板，采用文獻(xiàn)[9]建立的MH特異性 PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為LKT-F(5′-GCAGGAGGTGATTATTAAAGTGG-3′)和LK-T-R(5′-CAGCAGTTATTGTCATACCTGAAC-3′)，擴(kuò)增長度約為207 bp。

1.4 分離菌株的生化鑒定將純培養(yǎng)物按照常規(guī)方法接種于葡萄糖、麥芽糖、甘露醇等生化鑒定管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察其生化特性。

1.5 分離株的血清型鑒定采用KLIMA等[10]建立的MH A1、A2和A6血清型特異PCR方法，對MH血清型進(jìn)行鑒定，引物序列如表1。

表1 MH血清分型引物序列

1.6 分離菌株毒力基因檢測為了檢測分離菌株攜帶的重要毒力因子，參考 KLIMA等[11]建立的特異性 PCR 方法，分別對gcp、gs60、tbpB、lktC、nmaA和adh等毒力基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物信息見表2。

表2 MH主要毒力因子的引物序列

1.7 分離菌株對BALB/c小鼠的致病性從分離得到的19株MH分離株中，分別從屬于A1和A2血清型的菌株中各選取1株，參考文獻(xiàn)[2]對BALB/c小鼠進(jìn)行半數(shù)致死量(LD50)的測定。

1.8 lktA基因擴(kuò)增及序列分析本研究根據(jù)GenBank中提交的牛源、羊源MH相應(yīng)基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。由于lktA基因全長CDS較大，為了保證獲得有效擴(kuò)增，設(shè)計(jì)3對引物，對其進(jìn)行分段擴(kuò)增，引物信息見表3。反應(yīng)體系為20 μL，包括PCR-Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃總延伸10 min，16℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析，將目的條帶切膠回收，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表3 lktA基因擴(kuò)增引物

采用Lasergene的SeqMan軟件對lktA基因的分段片段進(jìn)行序列拼接獲得完整的CDS。采用NCBI的BLAST 工具對上述19個(gè)分離株和不同血清型以及不同宿主來源的MH lktA基因的同源性進(jìn)行分析，采用MAGA (Version7.0.26)軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，并針對lktA基因分析其基因亞型與菌株的血清型和宿主來源之間的關(guān)系。

1.9 分離菌株的藥物敏感性分析依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B紙片法對19株MH 分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑取純化后的單菌落接種于含5%馬血清的TSB培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)18 h。用 TSB 增菌液稀釋菌體濃度至 1.5×108CFU/mL，吸取100 μL稀釋好的菌液至含5%馬血清TSA平板上,并用滅菌涂布棒均勻涂布，貼藥敏片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。37℃恒溫培養(yǎng)18 h后判定結(jié)果，藥敏結(jié)果判定按NC-CLS 2012年標(biāo)準(zhǔn)記錄進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 MH的分離及特異性PCR鑒定將采集自40只患病綿羊的鼻拭子接種于血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h后，血平板上可見有β溶血單菌落，該菌落光滑、有光澤、呈中等大小的半透明狀(圖1)。經(jīng)革蘭染色鏡檢發(fā)現(xiàn)為兩端鈍圓的革蘭陰性短桿菌(圖2)。特異性PCR鑒定結(jié)果：分別從19只動(dòng)物中分離獲得19株MH，以S1～S19表示，部分菌株P(guān)CR檢測結(jié)果見圖3。

圖1 MH分離菌株菌落形態(tài)

圖2 MH分離菌株革蘭染色結(jié)果 (10×100)

2.2 分離菌株生化鑒定結(jié)果將19株分離菌株的純培養(yǎng)物接種于微量生化鑒定管內(nèi)，結(jié)果顯示：全部 19 株MH均發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和阿拉伯糖，不發(fā)酵脲酶、鼠李糖，其中 17 株發(fā)酵乳糖，16 株發(fā)酵蔗糖，14 株發(fā)酵木糖，符合MH的生化特性。重復(fù) 3 次，結(jié)果一致。

2.3 分離菌株的血清型鑒定采用MH血清型特異性PCR方法對19株分離株的血清型進(jìn)行鑒定。結(jié)果，其中7株均為A1型，11株為A2型，剩余1株并未擴(kuò)增出目的片段，為其他血清型。部分菌株血清型特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。

M. DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2～9.MH分離株

2.4 分離菌株的毒力基因鑒定對19株分離菌株的gcp、gs60、tbpB、lktC、nmaA和adh等毒力基因進(jìn)行檢測，結(jié)果表明gcp基因和lktC基因的陽性檢出率所占比例最高，達(dá) 17/19，而gs60、tbpB、nmaA和adh基因的陽性率分別為12/19，8/19，0/19，8/19。根據(jù)血清型分析，血清 A1 型中g(shù)cp基因和lktC基因所占比例最高，達(dá) 7/7，其次是gs60，其檢測率為 5/7，tbpB和adh基因檢測率較低，為2/7；血清 A2 型中l(wèi)ktC基因所占比例最高，達(dá) 10/11，其次是gcp基因，其檢測率為 9/11，gs60、tbpB和adh基因檢測率較低，為6/11。其中有 1 株A2 型MH均攜帶5種毒力基因gcp、gs60、tbpB、lktC和adh，但19株分離菌株均不含有nmaA基因(表4)。

A.血清型A1擴(kuò)增結(jié)果；B.血清型A2擴(kuò)增結(jié)果。M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2～7.MH分離株

表4 19株MH分離株6種毒力基因的分布情況 株

2.5 LD50的測定結(jié)果攻毒后6 h，小鼠出現(xiàn)精神沉郁、被毛粗亂、畏寒扎堆。8 h 后小鼠陸續(xù)死亡，連續(xù)觀察 24 h 記錄死亡個(gè)數(shù)并計(jì)算 LD50。結(jié)果顯示, S1 菌株的 LD50為1.34×107CFU/mL，S15 菌株的 LD50為 3.10×106CFU/mL,表明 S1 和S15 菌株對 BALB/c 小鼠均具有較強(qiáng)的致病性。

2.6 lktA基因的克隆和序列分析采用3對引物對分離株的lktA基因CDS全長進(jìn)行分段擴(kuò)增后進(jìn)行拼接,結(jié)果3對引物從所有19株分離株中擴(kuò)增獲得大小分別約為1 169，1 392,1 443 bp片段，與預(yù)期相符(圖5)。

A.lktA1引物擴(kuò)增結(jié)果；B.lktA2引物擴(kuò)增結(jié)果;C.lktA3 引物擴(kuò)增結(jié)果;1～5.MH分離株;M.DL2000 DNA Marker

為了進(jìn)一步分析19株分離株lktA基因的分子特征，本研究從GenBank中獲取來自不同動(dòng)物、不同血清型和文獻(xiàn)中報(bào)道的代表不同lktA等位基因型的MH共20株的lktA基因序列，與MH同屬的3株葡萄糖苷曼氏桿菌(Mannheimiaglucosidal)的lktA基因序列展開相關(guān)比較分析。結(jié)果顯示，19株分離株中，分離株S1、S2、S3、S5、S15、S16屬于lktA1型；分離株S6、S7、S17、S18屬于lktA8型；分離株S4屬于lktA6型。同時(shí)發(fā)現(xiàn)有5株分離株S8、S9、S10、S11、S12、S13、S19的lktA等位基因?qū)儆趌ktA4型(圖6)，此前，這一等位基因型被認(rèn)為是葡萄糖苷曼氏桿菌所特有。此外，本研究中的分離株S14屬于新的等位基因型，將其命名為lktA11。

圖6 MH lktA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.7 分離菌株的藥物敏感性分析對19株MH分離株，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果可見，分離株對復(fù)方新諾明的耐藥性最高，達(dá)到100%；對卡那霉素、氟苯尼考和丁胺卡那敏感；部分菌株對鏈霉素、阿奇霉素、頭孢氨芐、恩諾沙星和頭孢噻吩耐藥(表5)。

表5 19株MH分離株對藥物敏感性 %

3 討論

MH是引起山羊及綿羊呼吸道疾病的重要病原之一[12]。由MH引發(fā)羊發(fā)病死亡的確診報(bào)道及對病原的生物學(xué)特性分析較少。本研究從四川省某患有嚴(yán)重呼吸道疾病的綿羊場分離獲得19株MH，革蘭染色涂片為陰性短桿菌，在血瓊脂平板上可見光滑、半透明的菌落。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖、木糖，不發(fā)酵脲酶、鼠李糖，符合MH的生化反應(yīng)特性。

MH根據(jù)其莢膜抗原不同可分為12個(gè)血清型，即：A1、A2、A5～A9、A12～A14、A16和A17血清型，其中A1、A2、A6分布最為廣泛[13]。研究表明，A1型主要為引起牛呼吸道綜合征的血清型，其次是A6型[9]；而在羊源MH的感染中被認(rèn)為血清型 A1 和 A2更為常見[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，19株MH分離株中有7株為A1型，11株為A2型，研究結(jié)果與ABAY等[9]的試驗(yàn)結(jié)果一致。國內(nèi)對MH的血清型鑒定的研究較少，所以本研究結(jié)果可為MH血清型的鑒定提供參考依據(jù)。

毒力基因檢測結(jié)果表明，分離株均廣泛攜帶毒力因子。其中，gcp基因和lktC基因的陽性檢出率所占比例最高，達(dá) 17/19。gcp基因可以從宿主細(xì)胞表面分離糖蛋白[15]，有利于細(xì)菌定植及肺部感染的形成。lktC基因?qū)儆赗TX家族的成員之一，可使反芻動(dòng)物白細(xì)胞受損，從而使MH逃避宿主的免疫反應(yīng)，引起肺部炎癥和組織損傷[16]。而gs60、tbpB和adh基因的攜帶率率分別為12/19，8/19，8/19。gs60和tbpB為外膜脂蛋白基因，IOVANE等[17]證明外膜蛋白對嗜中性粒細(xì)胞具有趨化作用，并能夠抑制其吞噬作用和細(xì)菌殺傷作用，因此有利于MH在肺部的定植。adh基因參與細(xì)菌的黏附過程，使其能夠在機(jī)體內(nèi)定殖，造成機(jī)體損傷[18]。這些毒力基因在MH內(nèi)不同的攜帶率也提示著細(xì)菌間存在毒力差異。

在致病性試驗(yàn)中，2株菌株分別于攻毒后6 h，小鼠均出現(xiàn)精神沉郁，畏寒抱團(tuán)的現(xiàn)象，8 h后小鼠陸續(xù)死亡。在24 h內(nèi)S1和S15菌株致小鼠死亡數(shù)分別11和14只。S1和S15分離株的DL50分為1.34×107和3.10×106CFU/mL，表明這2株分離株對小鼠的致病性較強(qiáng)。韓小麗等[19]對小鼠的致病性研究發(fā)現(xiàn)，MH的致病性可能與毒力因子的攜帶情況以及血清分型有關(guān)。因此加深對小鼠以及本動(dòng)物的試驗(yàn)研究，可進(jìn)一步為MH的致病性研究提供參考。

白細(xì)胞毒素LKT是曼氏桿菌最為主要的毒力因子。研究發(fā)現(xiàn)[19]lktA基因有著復(fù)雜的鑲嵌結(jié)構(gòu)，可在不同種及菌株之間發(fā)生基因在水平方向上的重組，形成多種不同的等位基因型，表現(xiàn)出豐富的多樣性。此前的研究表明，不同的動(dòng)物源lktA等位基因型與其宿主來源存在相關(guān)性。DAVIES等[19]根據(jù)序列相似性將lktA分為lktA1～lktA10共10個(gè)等位基因型。其中，羊源菌株主要為lktA1、lktA2、lktA8和lktA10等多種等位基因型，而牛源菌株主要包括lktA1、lktA2型等位基因型，而等位基因型lktA4僅從同屬于曼氏桿菌的等位基因型中發(fā)現(xiàn)。本研究對19株MH的lktA基因序列的相似性進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)6株屬于lktA1型；4株屬于lktA8型；分離株S4屬于lktA6型。但本研究中鑒定的7株等位基因型屬于lktA4，而這一等位基因型屬于葡萄糖苷曼氏桿菌，該結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)羊源MH存在lktA4，也說明lktA基因在MH和葡萄糖苷曼氏桿菌之間發(fā)生了DNA的水平轉(zhuǎn)移和重組。本研究中的分離株S14屬于新的等位基因型，將其命名為lktA11，說明MH的lktA基因還存在更為豐富的等位基因型。

目前，針對動(dòng)物呼吸道疾病的發(fā)生多用抗生素治療，也正是由于抗生素藥物的普遍使用，導(dǎo)致我國羊源MH存在耐藥情況。王羽等[8]研究發(fā)現(xiàn)該菌對紅霉素、慶大霉素和磺胺間甲氧嘧啶耐藥。林裕勝等[7]研究發(fā)現(xiàn)其對氨芐西林、多黏菌素B和林可霉素耐藥。本研究對19株MH分離株進(jìn)行9 種臨床藥物的敏感性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MH分離株中，對復(fù)方新諾明的耐藥性最高，達(dá)到了100%，對卡那霉素、氟苯尼考和丁胺卡那敏感。

本研究從四川省某綿羊場患有呼吸道疾病的動(dòng)物中分離得到19株MH，并對其進(jìn)行分離鑒定，血清學(xué)、lktA基因型、主要毒力因子和藥物敏感性等生物學(xué)特性分析，結(jié)果不僅為該養(yǎng)殖場呼吸道疾病的防控提供參考，也為以后MH的生物學(xué)特性分析提供依據(jù)。