蓋塔病毒E2結(jié)構(gòu)域蛋白的原核表達及抗血清制備

仇相書，史 寧，朱翔宇，任世斌，張海森，李 海，魯會軍，金寧一*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春130122；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130122；4.昭蘇縣西域馬業(yè)有限責(zé)任公司，新疆 伊犁 835600)

GETV在分類上屬于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)的單股正鏈RNA病毒，其基因組長度約為11 689 nt，包含2個獨立的開放閱讀框架(open reading frames，ORF)，分別位于基因組5′端2/3部分(約7 407 nt)和后1/3部分(約3 759 nt)。前者負責(zé)非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein，NSP)NSP1～NSP4的編碼，NSP參與病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制、RNA capping以及多聚蛋白切割等過程；后者則負責(zé)編碼結(jié)構(gòu)蛋白，包括Capsid、E3、E2、6K和E1[10]。值得注意的是，由E基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白不僅構(gòu)成了病毒粒子的表面突起，而且是GETV吸附靶細胞及誘發(fā)機體抗感染免疫的關(guān)鍵蛋白[11]。E2蛋白主要由3個結(jié)構(gòu)域(A、B和C)組成，其中A和B包含影響免疫原性、病毒吸附和組織噬性的大部分殘基[12]。

本研究對GETV毒株序列進行比對分析后，選擇結(jié)構(gòu)蛋白E2結(jié)構(gòu)域保守區(qū)段為靶基因，參照實驗室保存的GETV SD17/09株(GenBank登錄號為MH106780.1)E2基因序列，擴增E2d結(jié)構(gòu)域基因，克隆至原核表達載體，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)重組蛋白E2d表達；E2d蛋白經(jīng)純化和透析后，免疫新西蘭兔，以期獲得抗E2d蛋白多克隆抗體，為開展E2蛋白功能研究、GETV檢測方法的建立和病原學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株與細胞株GETV毒株SD17/09、Vero細胞株由本實驗室保存；感受態(tài)細胞BL21(DE3)、DH5α購自大連TaKaRa公司。

1.2 試劑及其他反轉(zhuǎn)錄試劑盒Vazyme HiS-criptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit購自諾唯贊；Ex Taq PCR酶、T4DNA Ligase、DL5000 DNA Marker、載體pMDTM19-T、載體pET-22b(+)購自大連TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自BioFluX公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自杭州AXYGEN公司；NedⅠ和XhoⅠ、氨芐青霉素、20 000透析袋購自賽默飛公司；Anti-6×His tag抗體Abcam公司產(chǎn)品；山羊抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物公司；尿素、包涵體蛋白純化試劑盒購自大連TaKaRa；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自Sigma公司。

1.3 引物設(shè)計選擇GETV結(jié)構(gòu)蛋白E2結(jié)構(gòu)域保守區(qū)段為靶基因，參考GETV SD17/09株中的E2基因序列，設(shè)計含酶切位點的Getah-E2 domian片段擴增引物。上游引物Getah-E2d-F添加NdeⅠ酶切位點：cgcatatgACGAAACCGTACCTAGCGTA；下游引物GetahE2d-R添加XhoⅠ酶切位點：CTCGAGTTTGCCTTCAGTTGtc-agctga，斜體下劃線為限制性核酸內(nèi)切酶識別位點。擴增片段全長1 017 bp，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.4 目的基因獲取與擴增以GETV SD17/09株為模板，使用Vazyme HiS-criptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體操作按試劑盒說明書進行。使用上述合成引物將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過PCR進行擴增，PCR反應(yīng)體系：ddH2O 13.75 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL,模板4 μL、Ex Taq PCR酶0.25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 50 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的片段，克隆至pMDTM19-T載體。將其轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞并涂布于含有氨芐青霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基，挑取單克隆菌株在液體LB中培養(yǎng)14～16 h。提取質(zhì)粒后使用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定并測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD-Getah-E2d。

1.5 重組質(zhì)粒pET22b-Getah-E2d的構(gòu)建將驗證正確的pMD-Getah-E2d質(zhì)粒與原核表達載體pET-22b(+)分別用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的片段，T4DNA 連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于含有氨芐青霉素抗性的固體LB平板上，挑取單克隆菌株在液體LB中培養(yǎng)14～16 h，保存菌種并提取質(zhì)粒后分別用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定，將測序驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pET22b -Getah-E2d，保存菌種。

溝通的目的不是為了說服或壓制對方，而是要達成共識。所以很多父母其實并不懂得溝通的真正意義，他們認為好的溝通就是讓孩子變的聽話，如果不聽，那就是溝通不到位。這樣的溝通只會造成父母和子女之間內(nèi)心的隔閡，最終造成的結(jié)果就是，孩子對父母逐漸喪失了信任，那些原來可以和家長說的事情，以后再也不愿意和家長分享了。

1.6 重組蛋白Getah-E2d表達形式及鑒定將含有重組質(zhì)粒的BL-21(DE3)菌種以1∶100的比例接種至10 mL含有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h至D600值為0.4～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG繼續(xù)培養(yǎng)6 h。12 000 r/min離心10 min棄去上清，用原培養(yǎng)基1/5體積的PBS將沉淀充分重懸，在冰浴條件下進行超聲破碎至菌液澄清透亮，離心收集上清，并將沉淀完全重懸于與上清等體積的包涵體重懸液中(20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L Imidazol、0.5 mol/L NaCl、8 mol/L Urea、pH7.6)。分別取上清液和沉淀重懸液進行SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定，其中，以鼠源His抗體(1∶2 000稀釋)為一抗，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(1∶4 000 稀釋)為二抗。

1.7 Getah-E2d重組蛋白表達條件優(yōu)化

1.7.1最佳誘導(dǎo)時間確定 向試管中加入等量的pET22b-Getah-E2d重組菌，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h至D600值為0.4～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，分別于37℃條件下誘導(dǎo)表達0,2,4,6,8,10,12 h，收集菌體、超聲處理后進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.7.2最佳誘導(dǎo)溫度確定 前期處理同1.7.1，分別于16,26,37℃條件下誘導(dǎo)表達相同時間，收集菌體,超聲處理后進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.7.3最佳IPTG濃度確定 前期處理同1.7.1，分別加入終濃度為0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)表達，收集菌體,超聲處理后進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.8 Getah-E2d重組蛋白的純化及復(fù)性復(fù)蘇pET-22b-Getah-E2d重組菌，按1∶100比例接種至200 mL含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h至D600值為0.4～0.6時，按上述優(yōu)化的誘導(dǎo)條件進行表達。收集超聲處理后的蛋白樣品，參照包涵體蛋白純化試劑盒說明書使用His-bind純化柱對目的蛋白進行純化，取純化過程各個步驟的蛋白樣品通過SDS-PAGE進行鑒定，分析蛋白純化效果。

將純化后的包涵體蛋白裝入透析袋中，使用復(fù)性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、pH7.9、250 mmol/L NaCl、6 mol/L Urea)于4℃條件下透析6～8 h，并使用磁懸攪拌器低速攪拌；通過逐步降低復(fù)性液中Urea的含量：4，2，1，0 mol/L，并保持其他成分濃度不變，最后透析至PBS溶液中，達到包涵體復(fù)性的目的。收集復(fù)性后的蛋白，通過SDS-PAGE進行鑒定，并使用BCA蛋白定量試劑盒測定其濃度。

1.9 兔源多克隆抗體的制備選擇3只3月齡、體質(zhì)量2.0 kg的新西蘭兔，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，確認飲食飲水正常后，耳緣靜脈采集血清，通過中和抗體試驗確定血清中無GETV抗體(效價小于1∶4)后作為陰性血清。首免時(0 d)按800 μg/只的劑量，將復(fù)性后的Getah-E2d蛋白配伍等體積的完全弗氏佐劑，充分乳化成油包水制劑，背部多點皮下注射和肌肉注射。于首免后7,14,21 d將復(fù)性蛋白配伍等體積的不完全弗氏佐劑，進行3次加強免疫，免疫劑量為首免的50%。每次加強免疫前收集耳緣靜脈血，通過血清中和方法檢測血清效價。在24 d對兔進行心臟采血，收集血清，—20℃分裝保存。

1.10 兔源血清中和效價的檢測參考文獻[13]，將本實驗室保存的GETV SD17/09株用于本次血清中和試驗，通過用“固定病毒-稀釋血清”法檢測制備的兔源血清中和效價。將血清倍比稀釋(稀釋倍數(shù)從1∶4至1∶8 192)，分別與等體積的GETV病毒液(每孔100 TCID50/50 μL)混合，37℃、5% CO2孵育1 h。取混合液按100 μL/孔接種到單層Vero細胞(5×104個/孔)，37℃、5% CO2繼續(xù)孵育。3 d 后觀察細胞病變情況，按Reed-Muench方法計算并以完全抑制病毒生長的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)定義為中和抗體效價。

1.11 兔源多抗多克隆抗體的Western blot檢測以復(fù)性后的Getah-E2d重組蛋白和ETV為抗原，以本試驗制備的兔源抗Getah-E2d多抗血清(1∶2 000 稀釋)為一抗，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗(1∶4 000稀釋)，進行Western blot檢測，同時設(shè)置陰性血清對照組。

2 結(jié)果

2.1 Getah-E2d基因PCR擴增1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物在預(yù)期大小1 017 bp處出現(xiàn)條帶(圖1)。膠回收后經(jīng)TA連接克隆至pMDTM19-T載體，雙酶切鑒定和DNA測序結(jié)果顯示，該片段與原序列完全一致，表明目的基因擴增成功。

M.DL5000 DNA Marker；1.陰性對照；2.Getah-E2d PCR產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒pET22b-Getah-E2d的構(gòu)建與鑒定將測序正確的Getah-E2d基因連接至原核表達載體pET-22b(+)，使用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，切出1條大小約1 000 bp的條帶(圖2)，測序結(jié)果表明，Getah-E2d基因成功克隆至pET-22b(+)載體。

2.3 重組蛋白Getah-E2d表達形式及鑒定超聲破碎菌液后，分別對離心后的上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，上清液和沉淀皆能觀察到大小約38 kDa條帶，符合重組蛋白Getah-E2d預(yù)期大小，重組蛋白主要以包涵體形式表達(圖3A)；Western blot結(jié)果顯示，沉淀條帶單一，信號強，表明重組蛋白Getah-E2d具有良好的反應(yīng)原性(圖3B)。

2.4 Getah-E2d重組蛋白表達條件優(yōu)化通過對比不同誘導(dǎo)溫度，不同誘導(dǎo)時間和不同濃度IPTG誘導(dǎo)結(jié)果，最終確定最佳誘導(dǎo)條件為37℃、IPTG濃度0.8 mmol/L、誘導(dǎo)表達12 h(圖4)。

M.DL10000 DNA Marker；1.pET22b-Getah-E2d對照；2.pET22b-Getah-E2d雙酶切

A.SDS-PAGE；B.Western blot。1.BL-21對照；2.pET-22b空載體對照；3.重組蛋白pET22b-Getah-E2d上清；4.pET22b-Getah-E2d包涵體；M.蛋白Marker

2.5 Getah-E2d重組蛋白的純化及復(fù)性使用His-bind層析柱對Getah-E2d重組蛋白進行純化，純化后的蛋白進行SDS-PAGE鑒定，經(jīng)含500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后，可見約38 kDa的目的蛋白條帶(圖5)。經(jīng)梯度透析后，測得重組蛋白質(zhì)量濃度為0.5 g/L。

2.6 兔源多抗多克隆抗體中和效價的檢測以“固定病毒-稀釋血清”法對收集的兔血清進行中和抗體檢測，結(jié)果顯示，免疫后7，14，21，24 d血清中和效價分別為1∶128，1∶512，1∶1 024，1∶4 096。

A.不同誘導(dǎo)時間(A2～A8.誘導(dǎo)時間分別為0,2,4,6,8,10,12 h)；B.不同誘導(dǎo)溫度(B2～B4.誘導(dǎo)溫度分別為16,26,37℃)；C.不同誘導(dǎo)劑濃度(C2～C8.誘導(dǎo)劑濃度分別為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0,0.0 mmol/L)。M.蛋白Marker；1.Pet-22b空載體對照

M.蛋白Marker;1.pET22b-Getah-E2d純化前;2.穿流液;3.洗雜液;4.洗脫后;5.透析后

2.7 兔源多抗多克隆抗體的Western blot檢測分別以Getah-E2d重組蛋白和GETV全病毒為抗原，以制備的兔源抗Getah-E2d多抗血清(1∶2 000稀釋)和陰性血清為一抗進行Western blot檢測。結(jié)果顯示，陰性血清作用下，Getah-E2d組和Getah組均沒有出現(xiàn)條帶；而在制備的多抗血清作用下(免后24 d)，兩組在預(yù)期大小處均出現(xiàn)明顯的單一條帶，蛋白大小分別為38，46 kDa(圖6)

圖6 抗Getah-E2d兔源多抗對重組蛋白Getah-E2d及GETV的檢測

3 討論

近年來，我國GETV病的流行問題日益突出，對動物和公眾健康構(gòu)成極大威脅。雖然目前尚未證實GETV可引起人類疾病，但血清學(xué)研究顯示，流行區(qū)發(fā)熱病人或健康人群中存在該病毒特異性抗體[3]。長久以來，GETV被認為主要由伊蚊和庫蚊攜帶和傳播，但也有在按蚊和阿蚊中發(fā)現(xiàn)GETV的報道[14-15]，而這些種類的蚊蟲在中國廣泛分布，數(shù)量眾多。李元元等[16]將41株2014年以前分離的GETV毒株與1955年馬來西亞蚊蟲標(biāo)本分離的GETV-MM2021株比對，發(fā)現(xiàn)核苷酸和氨基酸同源性分別為93.8～100.0%和96.0～100.0%，這提示GETV E2結(jié)構(gòu)基因序列較為保守?；贓2基因核苷酸序列的進化分析，GETV毒株可分為Ⅰ～Ⅳ 4個群，1964年以后世界流行的大部分毒株屬于Ⅲ群[16]。

甲病毒屬病毒E2糖蛋白是一種嚢膜蛋白，具有很強的免疫原性[17]。該蛋白含有3個功能結(jié)構(gòu)域(A、B和C)，結(jié)構(gòu)域A和B暴露在病毒嚢膜上，參與病毒吸附過程。這些區(qū)域包含中和抗體的抗原表位，在臨床上已作為研發(fā)基孔肯雅病毒血清學(xué)診斷試驗的靶位點[18]。李向茸等[19]將GETV的E2部分基因(381 bp)克隆到表達載體pGEX-4T-1進行表達并以此為診斷抗原，建立了檢測豬GETV抗體的E2-ELISA方法，但可能由于靶基因不包含E2結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致診斷的特異性較低，且未見生產(chǎn)應(yīng)用。

本研究對GETV毒株序列進行比對分析后，選擇E2結(jié)構(gòu)域保守區(qū)段，截去結(jié)構(gòu)域兩端β帶狀結(jié)構(gòu)，擴增出1 017 bp的Getah-E2d基因片段，并克隆至帶有His標(biāo)簽的原核表達載體，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b-Getah-E2d。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定，重組蛋白E2d主要以包涵體形式表達；經(jīng)純化、透析后，將其免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。中和試驗結(jié)果顯示，免疫后24 d血清中和抗體效價達到最高，為1∶4 096；BANNAI等[20]將GETV毒株接種試驗馬獲得抗GETV馬源多抗血清，制備的多抗血清能與該GETV毒株發(fā)生反應(yīng)，在30，46，57 kDa出現(xiàn)條帶，分別與Capsid、E1或E2、NSP1或NSP3蛋白大小相對應(yīng)。Western blot顯示，本試驗制備的多抗血清能與Getah-E2d重組蛋白(約38 kDa)發(fā)生特異性反應(yīng)，同時能與GETV發(fā)生反應(yīng)，在約46 kDa處出現(xiàn)單一條帶，提示該血清與GETV的E1或E2發(fā)生特異性反應(yīng)，表明重組蛋白E2d具有良好的免疫原性，兔源多抗血清制備成功。綜上，本研究成功制備出Getah-E2d重組蛋白及兔源多抗血清，為開展GETV E2蛋白結(jié)構(gòu)域的功能研究、診斷方法的建立和疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。