pH對(duì)微波改性薏米蛋白功能特性的影響

張藝瑋，任靜，張舒，富天昕，馮玉超，王長(zhǎng)遠(yuǎn)*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

薏米，是一種傳統(tǒng)的藥食兼用谷物，廣泛種植于中國(guó)、日本和越南，被譽(yù)為“世界禾本科植物之王”[1]。薏米蛋白資源豐富，含18種氨基酸，包括8種人體必需的氨基酸，與FAO/WHO制定的黃金配比相接近[2]。但是對(duì)薏米蛋白的研究并不多，對(duì)改性薏米蛋白的研究報(bào)道更是較少見。在食品中添加改性蛋白可以增強(qiáng)其功能特性，其中物理改性方法具有安全無(wú)殘留及成本低廉等特點(diǎn)，所以對(duì)蛋白改性多采取物理方法，其中微波廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物和食品等科學(xué)研究[3]，微波對(duì)蛋白質(zhì)的破壞效果最強(qiáng)[4-5]，所以較常應(yīng)用于蛋白改性。pH是影響蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的主要因素之一，因此在微波改性蛋白研究中具有重要的參考價(jià)值。基于此，本實(shí)驗(yàn)選用微波改性的方法，以堿法提取的薏米蛋白進(jìn)行微波改性，并對(duì)其結(jié)構(gòu)及功能特性進(jìn)行測(cè)定，探討不同pH條件下微波改性后薏米蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性，使其在后期對(duì)薏米蛋白的改性提供理論依據(jù)，對(duì)促進(jìn)薏米蛋白在食品行業(yè)中的應(yīng)用及薏米產(chǎn)品的開發(fā)具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米、玉米色拉油：市售；牛血清蛋白、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、福林-酚試劑、石油醚(分析純)：購(gòu)自上海麥克林公司；溴化鉀(光譜純)：Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DELTA320精密pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Alpha 1-2LD Plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；CW-2000超聲微波萃取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司；HHS-21-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DGG-9140電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；A360型紫外-可見分光光度計(jì) 翱藝儀器(上海)有限公司；Quintik 224-1CN電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；FTIR傅里葉紅外光譜儀 美國(guó) Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 薏米蛋白的提取

將薏米清洗，去除雜質(zhì)，于烘箱中烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩，得到薏米粉。稱取適量薏米粉于燒杯中與石油醚以1∶5(m/V)的比例混合，攪拌5 h，得到脫脂薏米粉，晾干后置于密封袋中保存?zhèn)溆?。采用堿提酸沉法進(jìn)行薏米蛋白的提取，參照曹向宇等[6]的實(shí)驗(yàn)方法并進(jìn)行適當(dāng)改動(dòng)：脫脂薏米粉與蒸餾水按照1∶12(m/V)的比例混合，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10.5后，于37 ℃水浴鍋中加熱，并進(jìn)行攪拌4 h，之后置于4000 r/min的離心機(jī)中離心20 min，取上清液；用1 mol/L的HCl溶液將上清液的pH值調(diào)至等電點(diǎn)，靜置1 h，之后以4000 r/min離心2 min，棄上清液，取沉淀進(jìn)行冷凍干燥，于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 薏米蛋白的微波改性

于燒杯中稱取5 g薏米蛋白粉，添加100 mL蒸餾水，配制成濃度為5%的薏米蛋白水溶液，并用NaOH和HCl溶液(均為0.1 mol/L)，分別調(diào)節(jié)pH值為5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5，然后放入超聲微波萃取儀中，關(guān)閉超聲，設(shè)置微波功率100 W、溫度85 ℃、時(shí)間100 s進(jìn)行改性。改性后的蛋白溶液以4000 r/min離心20 min，取沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，于-20 ℃貯存?zhèn)溆肹7]。

1.3.3 溶解性的測(cè)定

參照賈聰?shù)萚8]的實(shí)驗(yàn)方法，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)母膭?dòng)。稱量0.5 g樣品，添加100 mL濃度為0.05 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH值為7)，放入37 ℃的水浴鍋中并攪拌30 min，靜置取出。于4000 r/min的離心機(jī)中離心20 min，取1 mL上清液于試管中，再依次加入1 mL堿性銅溶液和4 mL福林酚溶液，立即搖勻，于55 ℃的水浴中反應(yīng)5 min，置于冷水浴中10 min，取出后于650 nm處測(cè)定其吸光度值，按照下式計(jì)算溶解度。

(1)

1.3.4 乳化性、乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

用0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 7)，配制10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白溶液，加入2 mL玉米油，然后以10000 r/min的速度高速勻漿1 min，制成乳濁液，用微量注射器于液體底部取50 μL液體，放入預(yù)先加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%十二烷基硫酸鈉溶液(SDS)的試管內(nèi)，制成混合溶液，分別在0，10 min時(shí)，在500 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值A(chǔ)0、Aφ。乳化性、乳化穩(wěn)定性的計(jì)算公式如下[9]：

(2)

(3)

式中：A0為0 min時(shí)混合溶液的吸光度；Aφ為10 min時(shí)混合溶液的吸光度。

1.3.5 起泡性、起泡穩(wěn)定性的測(cè)定

參照Agyare等[10]的方法，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)母膭?dòng)。取1 g凍干的薏米蛋白粉，添加100 mL濃度為0.05 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 7)，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白溶液，然后以10000 r/min的高速均質(zhì)機(jī)進(jìn)行攪拌2 min，快速移至100 mL的量筒內(nèi)，記錄泡沫所占體積V0，將該量筒放入30 ℃的水浴鍋中靜置30 min，然后再次記錄泡沫所占體積V1。起泡性、起泡穩(wěn)定性的計(jì)算公式如下：

(4)

(5)

式中：V0為0 min時(shí)泡沫體積；V1為10 min時(shí)的泡沫體積。

1.3.6 紅外光譜的測(cè)定

參照林素麗[11]的實(shí)驗(yàn)方法，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。利用傅里葉紅外光譜分析法對(duì)改性后的薏米蛋白進(jìn)行分析，采用KBr壓片法，稱取0.0001 g的樣品和0.1 g的固體KBr于瑪瑙研缽中，研磨成均勻的粉末并壓成薄片。用傅里葉紅外光譜儀作全波長(zhǎng)掃描，波數(shù)范圍在0～4000 cm-1之間，分辨率在4 cm-1，波數(shù)精度在0.01 cm-1，掃描32次。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行，采用Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解性分析

蛋白質(zhì)在水溶液和鹽溶液中被溶解的性質(zhì)稱為溶解性，溶解效果較好的蛋白質(zhì)通常也具有較好的乳化性、起泡性、持油性和凝膠性等特點(diǎn)。具有良好溶解性的植物蛋白在食品工業(yè)中也具有良好的應(yīng)用前景，尤其是在飲料行業(yè)，植物蛋白近年來(lái)成為科研與實(shí)際生產(chǎn)中的熱點(diǎn)，改性后提高溶解性植物蛋白在貯存過(guò)程中可以抑制分層和沉淀現(xiàn)象，增強(qiáng)穩(wěn)定性，改善口感等[12]。

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.8171x+0.0002(R2=0.9983)。不同pH條件下微波改性后薏米蛋白的溶解性見圖1。

圖1 微波改性薏米蛋白的溶解性Fig.1 The solubility of microwave-modified coix seed protein

由圖1可知，pH值為5.5時(shí)，溶解度為47.7%。pH 6.5時(shí)的溶解度最低，僅為34.5%。隨著pH值的不斷升高，改性蛋白的溶解度也不斷增大，pH 7.5時(shí)的溶解度為42.2%，pH值為8.5時(shí)達(dá)到峰值，溶解度為67.7%，較未改性的薏米蛋白高出1.7%。pH 9.5與pH 8.5相差不大，分別為64.4%和67.7%，但隨著pH>8.5，溶解度在不斷降低，pH 10.5時(shí)溶解度為38.0%。

經(jīng)過(guò)微波改性后的蛋白，蛋白分子的二硫鍵被打破，結(jié)構(gòu)不再緊密，暴露更多親水基團(tuán)，增強(qiáng)溶解性。pH值為8.5時(shí)溶解度最大，可能是因?yàn)檩^高的pH值導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部因靜電排斥而造成分子伸展，蛋白質(zhì)分子粒徑增大，產(chǎn)生了部分可溶的蛋白質(zhì)聚集體[13]，從而使溶解度增大[14]。pH<8.5條件下的改性蛋白溶解度不高，主要因素之一為在等電點(diǎn)附近蛋白沉淀較多，蛋白易借靜電力形成較大的聚集體，不利于溶解。隨著溶液的環(huán)境趨向堿性，蛋白的溶解度均高于中性和弱酸性環(huán)境。

2.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性定性分析

互不相溶的兩種液體經(jīng)過(guò)機(jī)械攪拌形成均一乳化液的性質(zhì)為乳化性，是蛋白質(zhì)具有的一種特性。影響此特性的主要因素為蛋白質(zhì)分子鏈中的疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)，蛋白質(zhì)的存在決定了其表面活性[15]。

不同pH條件下微波改性對(duì)薏米蛋白乳化性的影響見圖2。

圖2 微波改性薏米蛋白的乳化性Fig.2 The emulsibility of microwave-modified coix seed protein

由圖2可知，pH 5.5時(shí)乳化性為0.0034 m2/g，在pH 6.5條件下，薏米蛋白的乳化性最低，僅為0.0012 m2/g；pH 7.5時(shí)，薏米蛋白的乳化性最佳，達(dá)到0.0076 m2/g，高出未改性薏米蛋白0.0016 m2/g。pH>7.5時(shí)，薏米蛋白的乳化性不斷降低，pH 8.5時(shí)乳化性為0.0038 m2/g，pH 9.5為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，乳化性為0.0022 m2/g，當(dāng)pH值繼續(xù)增大，薏米蛋白的乳化性不再降低，反而升高，pH 10.5時(shí)，乳化性升至0.0058 m2/g。

不同pH條件下微波改性后薏米蛋白的乳化穩(wěn)定性見圖3。

圖3 微波改性薏米蛋白的乳化穩(wěn)定性Fig.3 The emulsifying stability of microwave-modified coix seed protein

由圖3可知，pH 5.5和pH 7.5時(shí)的乳化穩(wěn)定性相差不大，分別為36%和37%。pH 6.5時(shí)乳化穩(wěn)定性為58%，其最好的乳化穩(wěn)定性為pH 8.5條件下的微波改性蛋白，達(dá)到79%，比未改性的薏米蛋白高出37%。pH 9.5時(shí)改性蛋白的乳化穩(wěn)定性為61%，隨著pH值不斷增大，乳化穩(wěn)定性也不斷降低，pH 10.5時(shí)改性蛋白的乳化穩(wěn)定性僅為24%。

圖2和圖3中乳化性和乳化穩(wěn)定性的變化趨勢(shì)呈相反狀態(tài)。但在等電點(diǎn)附近，其乳化性和乳化穩(wěn)定性都不高，推斷在此pH條件下改性蛋白只能微溶于溶液中，并且缺乏靜電排斥力，親水性降低，所以能夠依附在油/水界面上的蛋白質(zhì)減少，導(dǎo)致乳化性不高。在中性偏堿性的條件下，改性蛋白的乳化性有所提高，主要因素有微波處理后的蛋白分子更加松散，極性基團(tuán)和疏水基團(tuán)暴露的增加及柔性的增強(qiáng)[16]。隨著pH值的增大，乳化穩(wěn)定性降低，推測(cè)在堿性環(huán)境下改性的親水基團(tuán)增加，附著在油/水界面上的蛋白質(zhì)較之前減少，界面厚度減小，從而導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性降低。

2.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性分析

蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)機(jī)械攪打，在氣-液界面可以形成一層堅(jiān)韌的薄膜并使氣體并入且穩(wěn)定的能力稱為起泡性。分散的兩相間存有界面張力，蛋白能夠吸附在兩相之間降低其張力，同時(shí)產(chǎn)生一定的流變學(xué)特性和穩(wěn)定作用，并且作用于產(chǎn)生的吸附膜，增加膜的強(qiáng)度、粘度和彈性以對(duì)抗不利因素的能力稱為泡沫穩(wěn)定性[17]。

微波改性后的薏米蛋白在不同pH條件下的起泡性見圖4。

圖4 微波改性薏米蛋白的起泡性Fig.4 The foamability of microwave-modified coix seed protein

由圖4可知，pH 5.5時(shí)，改性蛋白的起泡性為38%，在pH 6.5時(shí)起泡性最低，僅為5%。隨著pH值的不斷增大，改性蛋白的起泡性得到改善，pH 7.5時(shí)起泡性為20%，pH 8.5時(shí)為最大值，達(dá)到54%，未改性薏米蛋白的起泡性為43%。當(dāng)pH>8.5時(shí)，起泡性降低，pH 9.5和pH 10.5時(shí)的起泡性分別為22%和29%。

微波改性薏米蛋白在不同pH條件下的泡沫穩(wěn)定性見圖5。

圖5 微波改性薏米蛋白的泡沫穩(wěn)定性Fig.5 The foaming stability of microwave-modified coix seed protein

由圖5可知，pH 5.5時(shí)，改性蛋白的泡沫穩(wěn)定性為42%，pH 6.5時(shí)泡沫穩(wěn)定性最佳，穩(wěn)定性達(dá)到80%。隨著堿性的增大，泡沫穩(wěn)定性逐漸下降，pH 8.5時(shí)，泡沫穩(wěn)定性最低，僅為29%，也高出未改性薏米蛋白8%，pH 9.5時(shí)略有升高，泡沫穩(wěn)定性為41%，pH 10.5時(shí)為30%。

良好的溶解度是蛋白質(zhì)呈現(xiàn)良好起泡性的重要條件，pH 8.5時(shí)溶解度和起泡性最好[18]。微波改性后的薏米蛋白，受微波作用而被極化，分子內(nèi)的非親水基團(tuán)暴露于分子表面，降低其表面張力，提高其起泡性。pH 6.5時(shí)的泡沫穩(wěn)定性最好而起泡性最差。隨著堿性增大，起泡性緩慢增加，泡沫穩(wěn)定性隨之下降，推測(cè)在堿性條件下，改性蛋白的溶解性得到改善，起泡部分為溶解部分，即起泡性也得到改善。但在攪打過(guò)程中沉淀的蛋白顆粒會(huì)通過(guò)靜電作用與泡沫結(jié)合，所形成的泡沫綿密穩(wěn)定，并且在等電點(diǎn)附近環(huán)境下的蛋白之間缺乏靜電排斥相互作用，利于在界面蛋白之間相互作用及形成黏稠的膜，所以泡沫穩(wěn)定性最好，pH增大，泡沫穩(wěn)定性下降。

2.4 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜分析是一種分析多肽和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)常用的方法，具有快捷、簡(jiǎn)單、高效等特點(diǎn)，廣泛用于鑒定食品、中草藥等混合體[19]。不同的官能團(tuán)和化學(xué)鍵對(duì)紅外光譜吸收不同，可以檢測(cè)到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

圖6 微波改性薏米蛋白的紅外光譜圖Fig.6 The infrared spectra of microwave-modified coix seed protein

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)薏米蛋白在不同pH值條件下進(jìn)行微波改性，采用堿提酸沉法提取薏米蛋白并對(duì)改性蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能性測(cè)定，在傅里葉紅外光譜分析中發(fā)現(xiàn)，pH 8.5條件下改性蛋白的吸收峰與未改性薏米蛋白相差不大，說(shuō)明結(jié)構(gòu)相似，改性后的薏米蛋白溶解性提高1.7%，乳化性提高0.0016 m2/g，乳化穩(wěn)定性提高37%，起泡性提高11%，泡沫穩(wěn)定性提高8%。通過(guò)分析說(shuō)明改性薏米蛋白的結(jié)構(gòu)變化越小，其功能性質(zhì)越好。磷脂P-H鍵的伸縮振動(dòng)可能與改性后的薏米蛋白功能性質(zhì)改善相關(guān)。綜上所述，微波改性中，不同pH值對(duì)薏米蛋白的結(jié)構(gòu)影響顯著。本研究對(duì)薏米蛋白的改性研究具有一定的參考意義。