不同品種大蒜提取物對層出鐮孢菌的抑菌作用分析

陳存，潘志佳，鄧艷，曾其國，劉應(yīng)平,任迎虹*

(1.成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 特色園藝生物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；2.成都師范學(xué)院 史地與旅游學(xué)院，成都 611130；3.四川省地質(zhì)調(diào)查院 稀有稀土戰(zhàn)略資源評價(jià)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610081)

鐮孢菌屬(Fusarium)真菌能造成蔬菜枯萎病[1]，會造成蔬菜大量減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)斐山^收，對我國農(nóng)業(yè)和食品業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)是瘤座孢科鐮刀菌屬的重要植物病原真菌，可侵染水稻、小麥、玉米、蘆筍等作物，引起枯萎病、腐爛病等[3]。目前關(guān)于防治層出鐮孢菌引起的植物病害的主要手段為化學(xué)農(nóng)藥抑制劑[4-5]，不僅對生態(tài)環(huán)境造成了破壞性的影響，還導(dǎo)致一些植物病原菌產(chǎn)生了耐藥性。生物農(nóng)藥具有無毒害、不易產(chǎn)生抗藥性、對環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，更重要的是對人體沒有毒害作用，符合人們對健康的追求[6-7]。大蒜(Alliumsativum)是蔥屬多年生草本植物，作為必不可少的調(diào)味品，其具有極大的藥用價(jià)值[8-9]，國內(nèi)外較多研究大蒜抑菌作用的報(bào)道[10-12]，但對不同品種間大蒜抑菌活性比較的研究鮮有報(bào)道，了解大蒜提取物對層出鐮孢菌的抑菌作用并初步探究其抑菌機(jī)理，能為進(jìn)一步開發(fā)新型環(huán)保生物源抑制劑提供指導(dǎo)性建議。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試大蒜：購自四川省成都市溫江區(qū)游家渡菜市場；供試菌株：層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

堿性磷酸酶測試盒、蛋白含量(BCA)測試盒：南京建成生物工程研究所；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)：上海博微生物科技有限公司；提取液：Tris(Phygene)，配制成pH 3.0的Tris-HCl溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SC-3610低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PHB-1筆型酸度計(jì) 上海世諾物理光學(xué)儀器有限公司；雷磁DDS-037型電導(dǎo)率儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV5100紫外可見分光光度計(jì) 安徽皖儀科技股份有限公司；KYC-100C空氣恒溫?fù)u床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ2D雙人單面超凈臺 蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；JEM-1230 型透射電鏡 JEOL日本電子公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 4種大蒜粗提物的制備[13]

將新鮮大蒜去皮后用研缽磨成糊狀，稱取5 g 4種不同大蒜分別與10 mL Tris-HCl(pH 3.0)溶液混合做好區(qū)分標(biāo)記(a，b，c，d)，常溫靜置2 h初提[14]，用濾紙過濾后將濾液以10000 r/min冷凍離心20 min，取上清液過0.22 μm無菌濾膜，將得到的大蒜提取液裝入EP管中，做好標(biāo)記，放入4 ℃冰箱中保存待用。

1.4.2 菌種活化和菌絲體的培養(yǎng)

在無菌條件下，用接種環(huán)蘸取菌懸液劃線接種于PDA斜面上，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，待其長出菌絲體轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱中備用。用無菌接種環(huán)刮取斜面上的菌絲體，并用無菌水沖洗制備層出鐮孢菌菌懸液，移取1 mL菌懸液于滅好菌的EP管中，用透氣膜封口，以8000 r/min冷凍離心5 min，棄上清(保留少許上清液)，放入4 ℃冰箱中備用。

1.4.3 抑菌圈的測定

采用牛津杯法[15]測定樣品的抑菌圈。在超凈工作臺中，取上述100 μL菌懸液在平板上均勻涂布，用鑷子在每個(gè)平板中放入5個(gè)牛津杯，分別加入20 μL 4種不同品種大蒜提取液，用 20 μL pH 3.0的Tris-HCl溶液作為對照，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。

1.4.4 相對電導(dǎo)率的測定

將收集到的菌絲體在PDB培養(yǎng)液中培養(yǎng) 2 d 后，每10 mL培養(yǎng)液中加入0.5 mL大蒜提取液，經(jīng)120 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)，采用電導(dǎo)儀測定相對電導(dǎo)率，分別于 0，1，2，4，6，8，12 h 時(shí)以無菌水為對照測定電導(dǎo)率，每個(gè)樣品重復(fù) 3 次。

1.4.5 蛋白濃度的測定

采用蛋白定量(BCA)測試盒對菌液總蛋白濃度進(jìn)行測定。上述加入大蒜提取液的培養(yǎng)液分別于0，4，8，12，16 h時(shí)收集培養(yǎng)液，以4000 r/min進(jìn)行離心，取上清液備用，每個(gè)樣品重復(fù)3次，按表1中比例稀釋樣液。

表1 總蛋白含量測定操作表Table 1 The determination of total protein content

旋渦混勻，靜置5 min，526 nm波長，水調(diào)零OD值。采用下列公式對總蛋白濃度進(jìn)行計(jì)算：

式中：A1為測定管吸光度；A2為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；A0為空白管吸光度；ρ為標(biāo)準(zhǔn)液濃度，563 μg/mL；D為樣本測定前稀釋倍數(shù)。

1.4.6 堿性磷酸酶(AKP)酶活性的測定

采用堿性磷酸酶測試盒對菌液AKP酶進(jìn)行測定。上述加入大蒜提取液的培養(yǎng)液分別于0，4，8，10，12，14，16 h時(shí)收集培養(yǎng)液，每個(gè)樣品重復(fù)3次，再按照表2進(jìn)行操作。

表2 AKP酶活性測定操作表Table 2 The determination of AKP enzyme activity

根據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：A1為測定管吸光度；A2為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；m為標(biāo)準(zhǔn)管含酚的量，0.005 mg。

式中：A1為測定管吸光度；A2為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；V1為取樣量，0.03 mL；ρ為待測樣本蛋白濃度，mgprot/mL；m為標(biāo)準(zhǔn)管含酚的量，0.003 mg。

1.4.7 透射電鏡觀察

將層出鐮孢菌接種于加入“紅七星”提取物濃度為5×10-3g/mL的PDA培養(yǎng)基中，對照用無菌水，培養(yǎng)48 h后在菌落邊緣取樣用于透射電鏡下觀察。

樣品的固定:采用戊二醛、鋨酸雙重固定法。取材灌注固定：快速取材，切取1 mm×1 mm菌塊，用生理鹽水清洗菌塊，在 4 ℃用2.5%戊二醛進(jìn)行前固定 2 h以上；用磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.2)沖洗 4～6次；再用1%鋨酸后固定 2.5 h；0.1 mol/L，pH 7.2 的磷酸緩沖液沖洗 4～6次；1%醋酸鈾塊染 2 h；乙醇梯度(30%、50%、70%、90%、95%、100%，3次)脫水；環(huán)氧丙烷代換 2 次；環(huán)氧丙烷∶epon樹脂為2∶1 滲透2 h，環(huán)氧丙烷∶epon 樹脂為1∶2 滲透 2 h，純樹脂滲透過夜；進(jìn)行包埋，37 ℃聚合12 h，45 ℃聚合12 h，60 ℃聚合48 h；最后半薄切片光鏡定位，于JEM-1230型透射電鏡下觀察并拍照。

1.4.8 不同品種大蒜氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析

將不同品種大蒜提取液通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行分析，分析條件：TG-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣，電離電壓：70 eV，流速1 mL/min，柱溫：60 ℃維持5 min，再以10 ℃/min的速度升至220 ℃。分析得到的數(shù)據(jù)用MS數(shù)據(jù)庫NIST05.LIB和NIST05s.LIB進(jìn)行光譜分析和化合物鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種不同大蒜的抑菌性

以抑菌圈的大小研究4種不同品種大蒜提取液的抑菌活性，抑菌圈的直徑越大，抑菌活性越大。抑菌效果見圖1。

圖1 4種粗提液在接種培養(yǎng)基上形成的抑菌圈Fig.1 The inhibition zone formed by four kinds of extracts on inoculation medium注：a為二水早；b為獨(dú)蒜；c為紅七星；d為太倉白皮；e為對照。

由圖1可知，“紅七星”的提取液對層出鐮孢菌的抑菌效果最明顯，達(dá)到20 mm以上，其次是“二水早”，抑菌圈直徑達(dá)16 mm，“獨(dú)蒜”為10 mm，“太倉白皮”為8 mm，“獨(dú)蒜”和“太倉白皮”的抑菌效果不如“紅七星”和“二水早”明顯。

2.2 相對電導(dǎo)率

4種不同大蒜提取物對層出鐮孢菌相對電導(dǎo)率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 4種不同大蒜提取物對層出鐮孢菌相對電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of four kinds of garlic extracts on the relative conductivity of Fusarium proliferatum注：C為對照；T為太倉白皮；S為獨(dú)蒜；E為二水早；H為紅七星。

由圖2可知，當(dāng)層出鐮孢菌菌液中未加入大蒜提取物時(shí)(C對照)，菌液的電導(dǎo)率由培養(yǎng)1 h時(shí)的0.06%增加到培養(yǎng)12 h后的2.15%，增加幅度很小。而當(dāng)分別加入4種不同大蒜提取物時(shí)，12 h后菌液的電導(dǎo)率分別增加至4.69%、5.89%、16.00%、20.02%，其中“紅七星”的相對電導(dǎo)率變化最大。相對電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜通透性的重要指標(biāo)，其值越大，表示電解質(zhì)的滲漏量越大，細(xì)胞膜的完整性受到的破壞程度也就越大[16]。當(dāng)它受到破壞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鉀離子、質(zhì)子等電解質(zhì)大量外泄，致使細(xì)菌細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)過“紅七星”和“二水早”提取物處理后的菌液的相對電導(dǎo)率較高，說明“紅七星”和“二水早”的抑菌效果較佳。

2.3 蛋白濃度

4種不同大蒜提取物對層出鐮孢菌總蛋白濃度的影響結(jié)果見圖3。

圖3 4種不同大蒜提取物對層出鐮孢菌總蛋白濃度的影響Fig.3 Effect of four kinds of garlic extracts on the total protein content of Fusarium proliferatum注：C為對照；T為太倉白皮；S為獨(dú)蒜；E為二水早；H為紅七星。

由圖3可知，未加入大蒜提取物的菌液培養(yǎng)12 h后相對于培養(yǎng)4 h時(shí)蛋白含量增加了16.78 μg/mL，而當(dāng)分別加入4種大蒜提取物培養(yǎng)12 h后，相對于培養(yǎng)4 h時(shí)分別增加了42.11，53.67，135.06，143.72 μg/mL。相比于對照組和其他兩種大蒜提取物對菌體總蛋白濃度的影響可以得出，“紅七星”和“二水早”導(dǎo)致菌體蛋白泄露最多。管敏等[17]在研究對金黃色葡萄球菌的抗菌機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌懸液中總蛋白濃度越高，表明金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性受到的破壞程度越大。通過對細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞，細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)含物(主要是蛋白質(zhì))大量外泄，導(dǎo)致菌液中蛋白含量較高，說明“紅七星”和“二水早”對細(xì)胞的破壞程度最大，其抑菌效果也最佳。

2.4 堿性磷酸酶(AKP)活性

4種不同大蒜提取物對層出鐮孢菌AKP酶活性的影響結(jié)果見圖4。

圖4 4種不同大蒜提取物對層出鐮孢菌AKP酶活性的影響Fig.4 Effect of four kinds of garlic extracts on AKP enzyme activity of Fusarium proliferatum注：C為對照；T為太倉白皮；S為獨(dú)蒜；E為二水早；H為紅七星。

由圖4可知，未加入大蒜提取物時(shí)，菌液中AKP酶活性很小，變化也不大。但當(dāng)加入4種不同大蒜提取物后，培養(yǎng)了12 h 時(shí)AKP酶活性相對于培養(yǎng)4 h時(shí)分別增加了27.74，40.29，154.70，201.09金氏單位/100 mL，其中加入“紅七星”和“二水早”的菌液中AKP酶活性很高。AKP酶[18]是衡量細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)之一，主要參與細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)細(xì)菌處于一個(gè)對其有害的環(huán)境時(shí)，AKP酶的活性會增強(qiáng)。菌懸液中AKP酶的活性越高，說明菌體細(xì)胞受到的破壞越大，由此得出，“紅七星”和“二水早”的抑菌效果最佳。

2.5 鐮孢菌細(xì)胞形態(tài)的變化

“紅七星”提取物處理前后細(xì)胞的形態(tài)變化結(jié)果見圖5。

圖5 “紅七星”提取物處理前后細(xì)胞的形態(tài)變化Fig.5 The morphological changes of cells before and after treatment with "Hongqixing" extracts注：A為未加紅七星提取物時(shí)的細(xì)胞形態(tài)；B為加入紅七星提取物后的細(xì)胞形態(tài)。

圖5中A表示當(dāng)層出鐮孢菌菌液中未加入大蒜提取物時(shí)細(xì)胞呈完整的圓形，當(dāng)加入了抑菌活性最佳的“紅七星”大蒜提取物后菌體的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則(見圖5中B)，主要是由于其細(xì)胞壁遭到了破壞，使得維持細(xì)胞形態(tài)的功能喪失，“紅七星”大蒜良好的抑菌作用就是通過破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞不能進(jìn)行正常的生命活動而死亡。

2.6 不同品種大蒜的GC-MS分析圖譜

4種不同大蒜提取物GC-MS圖譜分析結(jié)果見圖6。

圖6 4種不同大蒜提取物GC-MS圖譜分析Fig.6 GC-MS chromatogram analysis of four kinds garlic extracts注：a為太倉白皮；b為紅七星；c為二水早；d為獨(dú)蒜；1為乙酸，2為2-氨基-5-甲基苯甲酸，3為3-乙烯基-1,2-二硫雜環(huán)己-4-烯，4為3-乙烯基-1,2-二硫雜環(huán)己-5-烯，5為 5-羥甲基糠醛，6為二烯丙基三硫化物(DATS)，7為β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡萄糖苷。

在GC-MS檢測到的多種揮發(fā)性化合物中，含量較高的包括酸類化合物、雜環(huán)類化合物、醛類化合物、含硫化合物等，其中含硫化合物以3-乙烯基-1,2-二硫雜環(huán)己-4-烯、3-乙烯基-1,2-二硫雜環(huán)己-5-烯、二烯丙基三硫化物為主?！凹t七星”提取液中揮發(fā)性物質(zhì)主要成分為5-羥甲基糠醛、β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡萄糖苷、3-乙烯基-1,2-二硫雜環(huán)己-5-烯；“二水早”提取液中揮發(fā)性物質(zhì)主要成分為5-羥甲基糠醛、2-氨基-5-甲基苯甲酸、β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡萄糖苷；“太倉白皮”中揮發(fā)性物質(zhì)主要成分為乙酸、2-氨基-5-甲基苯甲酸、β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡萄糖苷；“獨(dú)蒜”中揮發(fā)性物質(zhì)主要成分為2-氨基-5-甲基苯甲酸、β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡萄糖苷。這些大蒜粗提物中的硫化物以二硫化物和三硫化物為主，二硫化物以3-乙烯基-1,2-二硫雜環(huán)己-4-烯、3-乙烯基-1,2-二硫雜環(huán)己-5-烯為主，三硫化物以二烯丙基三硫化物為主。此外，在大蒜“紅七星”和“二水早”提取液中均大量存在的5-羥甲基糠醛，在“太倉白皮”和“獨(dú)蒜”提取液中并不存在或有非常少量的存在，同時(shí)，“紅七星”和“二水早”的硫化物含量和抑菌活性也高于其他兩種大蒜。有研究顯示，大蒜提取物中的抑菌活性成分非常復(fù)雜，是由多種成分共同作用的，其中包括易揮發(fā)和易分解的化合物，也包括穩(wěn)定和不易揮發(fā)的化合物，其中易揮發(fā)含硫化合物是主要的抑菌活性成分[19]。

3 結(jié)論

通過透射電鏡圖發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜提取物處理過的層出鐮孢菌細(xì)胞形態(tài)變化顯著，由此可得，大蒜對菌體的抑制作用主要表現(xiàn)在破壞其細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性。通過測定大蒜處理后的菌液中相對電導(dǎo)率、總蛋白濃度和堿性磷酸酶的濃度變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過處理后的菌液3項(xiàng)指標(biāo)均遞增的變化趨勢與大蒜抑菌圈的大小呈正相關(guān)，并綜合得出抑菌效果最佳的大蒜品種。通過GC-MS分析圖譜明確了4種不同品種大蒜中揮發(fā)性物質(zhì)的種類和其含量各不相同，其中易揮發(fā)含硫化合物是其主要的抑菌活性成分，含硫化合物主要以二硫化合物和三硫化合物為主，其中二烯丙基三硫化物的抑菌效果最佳，但抑菌效果較好的“紅七星”和“二水早”中含量較高的5-羥甲基糠醛也值得關(guān)注。目前較多研究均是以粗提物或混合物為對象，有關(guān)大蒜提取物中到底是哪一種或哪幾種物質(zhì)在起作用并沒有詳細(xì)報(bào)道。本課題為今后不同品種大蒜提取物中具體活性成分的研究提供了基礎(chǔ)條件，同時(shí)為新型生物農(nóng)藥的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。