硬枝堿蓬多糖通過腸肌間神經(jīng)叢抑制家兔離體十二指腸收縮及機(jī)制*

沙愛龍，郝海燕

1. 重慶三峽學(xué)院教師教育學(xué)院，重慶 404120

2. 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院/重慶市渝東北特色生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，重慶 404120

3. 重慶三峽學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院/三峽庫(kù)區(qū)水環(huán)境演變與污染防治重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 404120

硬枝堿蓬Suaeda rigidaKung et G. L. Chu，屬石竹目Caryophyllales 藜科Chenopodiaceae 堿蓬屬Suaeda中最高大的雙子葉植物，為塔里木盆地特有種［1］，主要分布于新疆阿克蘇-巴楚一線地區(qū)，生活力強(qiáng)、生物量大、營(yíng)養(yǎng)成分含量高，當(dāng)?shù)鼐用癯２杉淠廴~以作野菜食用。因?yàn)橛仓A蓬分布范圍狹窄，其分布區(qū)人口密度低，科研院所、高校少，故目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究報(bào)道很少。本課題組前期對(duì)硬枝堿蓬的化學(xué)成分及藥理作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明硬枝堿蓬含有多糖、生物堿、揮發(fā)油、黃酮、皂甙等化學(xué)成分［2］，具有抗氧化［3］、促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)及抗病能力等藥理作用［4］。筆者曾研究硬枝堿蓬多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清中NO 含量及NOS 活性的影響，結(jié)果表明，硬枝堿蓬多糖可通過顯著抑制NOS 并最終抑制NO 的細(xì)胞毒性作用而對(duì)正常組織細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，并進(jìn)一步增強(qiáng)小鼠的免疫力［5］，由此可推斷多糖可能是硬枝堿蓬重要活性成分之一。目前有關(guān)硬枝堿蓬多糖其他藥理作用的研究尚未見報(bào)道。已有研究表明植物多糖可影響小腸收縮［6-7］，本實(shí)驗(yàn)擬通過硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸平滑肌收縮性的影響及其作用機(jī)制，研究硬枝堿蓬中抑制胃腸運(yùn)動(dòng)的有效成分，以期為新藥的研發(fā)提供新思路，也可為治療胃腸運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)和硬枝堿蓬的開發(fā)利用提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年家兔，體質(zhì)量2.0 ～2.5 kg，雌雄不拘，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)站提供。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑硬枝堿蓬，采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師阿拉爾市十二團(tuán)，經(jīng)課題組鑒定。蛋白酶抑制劑購(gòu)自Sigma 公司，氯化乙酰膽堿（Ach）、硫酸阿托品、鹽酸維拉帕米均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，亮氨酸腦啡肽（Leu-enk）ELISA 試劑盒、甲硫氨酸腦啡肽（Met-enk）ELISA 試劑盒均購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司，酪氨酸羥化酶（TH）ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)ProSci公司，樂氏液（KCl 0.42 g，NaCl 9 g，CaCl20.24 g，NaHCO30.2 g，葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 000 mL；所用試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2 儀器MedLab-U/4C501 型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（南京美易科技有限公司），JZ101 型張力換能器（北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司），HW-400E 恒溫平滑肌槽（成都泰盟科技有限公司），PowerWave XS 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 寶特），低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），精密電子天平（上海精科天平），電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 硬枝堿蓬多糖的提取方法按照課題組先前的研究方法制備硬枝堿蓬多糖［5］。將制備得到的灰白色固態(tài)絮狀硬枝堿蓬多糖2.00 g，置于100 mL 容量瓶中用蒸餾水溶解，即得高質(zhì)量濃度硬枝堿蓬多糖溶液（20 mg/mL）。后稀釋2次，各稀釋1倍，分別得到10、5 mg/mL 中、低質(zhì)量濃度的硬枝堿蓬多糖溶液。

1.3.2 家兔離體十二指腸平滑肌標(biāo)本的制備及收縮活動(dòng)記錄家兔禁食24 h 后，采用頸椎脫臼處死，迅速剖開上腹，剪取靠近胃幽門端的十二指腸段約2 cm，輕輕剝離附著其上的脂肪組織，而后置于37 ℃樂氏液中。穩(wěn)定10 min 后，用棉線將十二指腸段一端連張力換能器并連接MedLab 生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，另一端系于恒溫平滑肌槽試驗(yàn)片底端L 型鉤上，試驗(yàn)片置于盛有18 mL 樂氏液的試驗(yàn)管內(nèi)，調(diào)節(jié)棉線剛好垂直，使離體腸段懸浮于實(shí)驗(yàn)管中央。設(shè)定恒溫平滑肌槽水溫37 ℃，每秒鐘通過內(nèi)置氣泵通入1～2 個(gè)氣泡。記錄腸段收縮曲線，穩(wěn)定10 min 后，開始實(shí)驗(yàn)，記錄指標(biāo)包括收縮頻率和收縮幅度。

1.3.3 不同質(zhì)量濃度硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響實(shí)驗(yàn)采用分別加入的方法，即加入一種質(zhì)量濃度的硬枝堿蓬多糖并觀察其效果后，用37 ℃樂氏液沖洗2～3 次，再加入另一質(zhì)量濃度硬枝堿蓬多糖。按照低（5 mg/mL）、中（10 mg/mL）、高（20 mg/mL）質(zhì)量濃度的順序依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各質(zhì)量濃度硬枝堿蓬多糖加入試驗(yàn)管后分別觀察記錄6 min，以加藥前1 min的腸段收縮曲線作為對(duì)照，記錄3個(gè)質(zhì)量濃度組的硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響，并計(jì)算收縮頻率和幅度的變化率

為了研究硬枝堿蓬多糖對(duì)十二指腸平滑肌收縮影響的作用機(jī)制，按照“1.3.4～1.3.6”所述方法繼續(xù)設(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 硬枝堿蓬多糖對(duì)ACh誘導(dǎo)的家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響待十二指腸段收縮曲線穩(wěn)定后，向試驗(yàn)管內(nèi)加入ACh（0.1 μmol/L），作用3 min 后加入高質(zhì)量濃度硬枝堿蓬多糖（20 mg/mL），此期間觀察記錄家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的變化。另設(shè)一組用硫酸阿托品（1 μmol/L）作為陽性對(duì)照。

1.3.5 硬枝堿蓬多糖對(duì)CaCl2誘導(dǎo)的家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響待腸段收縮曲線穩(wěn)定后，向試驗(yàn)管內(nèi)加入CaCl2（0.1 mol/L），作用3 min 后加入高質(zhì)量濃度硬枝堿蓬多糖（20 mg/mL），此期間觀察記錄家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的變化。另設(shè)一組用鹽酸維拉帕米（0.1 μmol/L）作為陽性對(duì)照。

1.3.6 硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸中Leuenk、Met-enk含量和TH活性的影響將36 只家兔隨機(jī)分為4 組，即正常對(duì)照組（樂氏液組），低、中、 高質(zhì)量濃度硬枝堿蓬多糖組（n=9）。制備各組家兔離體十二指腸平滑肌標(biāo)本，分別取樂氏液和低、中、高質(zhì)量濃度硬枝堿蓬多糖浸浴各組離體十二指腸腸段，6 min 后，將腸段剪碎，置于9倍的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，加入蛋白酶抑制劑后用冰水浴勻漿10 min 制成10%組織勻漿，經(jīng)反復(fù)凍融3 次后，5 000 r/min 離心5 min 后取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書分別測(cè)定各組Leu-enk、Met-enk含量和TH活性。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，數(shù)據(jù)分析在SPSS 19.0軟件上進(jìn)行。組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較選用Dunnett-t檢驗(yàn)。P<0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸收縮頻率的影響

與給藥前相比，硬枝堿蓬多糖3個(gè)劑量組對(duì)家兔離體十二指腸收縮頻率均具有抑制作用，其中低劑量組抑制不顯著（P>0.05）、中劑量組抑制顯著（P<0.05）、高劑量組抑制極顯著（P<0.01），抑制率也隨劑量升高而逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。

表1 硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸收縮頻率的影響1）（n=9）Table 1 Effects of Suaeda rigida polysaccharides on the contractile frequency of the isolated duodenum in rabbits（n=9）

2.2 硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸收縮幅度的影響

由表2 可知，與給藥前相比，硬枝堿蓬多糖3個(gè)劑量組對(duì)家兔離體十二指腸收縮幅度均具有抑制作用，其中低劑量組抑制不顯著（P>0.05）、中劑量組抑制顯著（P<0.05）、高劑量組抑制極顯著（P<0.01），其抑制率隨劑量升高而逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。

表2 硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸收縮幅度的影響1）（n=9）Table 2 Effects of Suaeda rigida polysaccharides on the contractile amplitude of the isolated duodenum in rabbits（n=9）

2.3 硬枝堿蓬多糖對(duì)ACh 誘導(dǎo)的家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響

由表3可知，與給藥前相比，單獨(dú)應(yīng)用ACh極顯著增加了家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度（P<0.01）。加入硬枝堿蓬多糖（20 mg/mL）后，收縮頻率和幅度均明顯下降，作用效果與硫酸阿托品相當(dāng)，與ACh 相比差異均極顯著（P<0.01）。

表3 硬枝堿蓬多糖對(duì)ACh誘導(dǎo)的家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響1）（n=9）Table 3 Effects of Suaeda rigida polysaccharides on the frequency and amplitude of contraction of the isolated rabbit duodenum induced by ACh（n=9）

2.4 硬枝堿蓬多糖對(duì)CaCl2誘導(dǎo)的家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響

由表4 可知，與給藥前相比，單獨(dú)應(yīng)用CaCl2極顯著增加了家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度（P<0.01）。加入硬枝堿蓬多糖（20 mg/mL）后，與CaCl2相比，收縮頻率和幅度均極顯著降低（P<0.01），作用效果與鹽酸維拉帕米相當(dāng)。

表4 硬枝堿蓬多糖對(duì)CaCl2誘導(dǎo)的家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響1）（n=9）Table 4 Effects of Suaeda rigida polysaccharides on the frequency and amplitude of contraction of the isolated rabbit duodenum induced by CaCl2（n=9）

2.5 硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸Leu-enk、Met-enk含量和TH活性的影響

硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸組織中Leu-enk、Met-enk 含量和TH 活性的影響結(jié)果見表5。與正常對(duì)照組相比，硬枝堿蓬多糖3 個(gè)劑量組家兔離體十二指腸組織中Leu-enk、Met-enk 含量均減少，其中低劑量組差異不顯著（P>0.05），而高劑量組差異均極顯著（P<0.01）；中劑量組的Leu-enk 差異不顯著（P>0.05），但Met-enk 差異卻極顯著（P<0.01）。硬枝堿蓬多糖3 個(gè)劑量組家兔離體十二指腸中TH 活性均高于正常對(duì)照組，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)趨勢(shì)，其中低劑量組差異不顯著（P>0.05），而中、高劑量組差異均極顯著（P<0.01）。

表5 硬枝堿蓬多糖對(duì)家兔離體十二指腸Leu-enk、Met-enk含量和TH活性的影響（n=9）Table 5 Effects of Suaeda rigida polysaccharides on the contents of Leu-enk and Met-enk and the activity of TH in the isolated duodenum of rabbit（n=9）

3 討 論

與骨骼肌類似，十二指腸平滑肌收縮也是在肌膜動(dòng)作電位觸發(fā)下發(fā)生興奮-收縮耦聯(lián)，觸發(fā)因子也是Ca2+，不同處在于Ca2+濃度的調(diào)控存在電-機(jī)械耦聯(lián)和藥物-機(jī)械耦聯(lián)兩條途徑［8］。電-機(jī)械耦聯(lián)使肌膜中的ICa-L將細(xì)胞外Ca2+釋放進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)；藥物-機(jī)械耦聯(lián)是外源性藥物通過激活G 蛋白耦聯(lián)受體-磷脂酶C（PLC）-三磷酸肌醇（IP3）信號(hào)通路生成IP3，最終介導(dǎo)肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放進(jìn)胞質(zhì)中引起的［8］。

十二指腸的活動(dòng)受神經(jīng)和體液因素的影響。體液因素包括十二指腸平滑肌細(xì)胞膜上存在的多種離子通道和受體，當(dāng)信使分子激活離子通道時(shí)或神經(jīng)遞質(zhì)、外源藥物與膜上受體結(jié)合時(shí)會(huì)引起平滑肌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生變化，由此調(diào)控其運(yùn)動(dòng)。神經(jīng)因素包括外來神經(jīng)（交感和副交感）和腸神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，家兔十二指腸離體后雖失去外來神經(jīng)的支配，但腸神經(jīng)系統(tǒng)仍存在［9］。腸神經(jīng)系統(tǒng)由胃腸道壁內(nèi)兩層神經(jīng)結(jié)構(gòu)組成，內(nèi)含大量神經(jīng)元和神經(jīng)纖維，可分為肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢，其中黏膜下神經(jīng)叢主要調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和腺細(xì)胞功能，而位于環(huán)形肌和縱行肌之間的肌間神經(jīng)叢則主要支配平滑肌的活動(dòng)［8］。十二指腸平滑肌運(yùn)動(dòng)主要受肌間神經(jīng)叢調(diào)節(jié)和支配，構(gòu)成肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)元通過釋放不同的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)十二指腸運(yùn)動(dòng)，這些神經(jīng)遞質(zhì)可分為兩類，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如Ach、腦啡肽（Enk）、P 物質(zhì)等可促進(jìn)十二指腸運(yùn)動(dòng)［10］，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)如腎上腺素、去甲腎上腺素（NE）、生長(zhǎng)抑素等則起抑制作用［11］。

Ach 是十二指腸運(yùn)動(dòng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，與腸肌膜上的G蛋白耦聯(lián)M受體結(jié)合后激活腺苷酸環(huán)化酶（AC），使細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）濃度升高，激活蛋白激酶A（PKA），進(jìn)而激活I(lǐng)Ca-L使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流增多［12］。Ach 還可以通過與M 受體結(jié)合后激活G 蛋白亞型耦聯(lián)受體，再激活PLC，產(chǎn)生IP3和二酰甘油（DG），再激活肌漿網(wǎng)膜中的IP3受體，肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放進(jìn)胞質(zhì)中，從而導(dǎo)致十二指腸平滑肌收縮增強(qiáng)［13］。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，硬枝堿蓬多糖能極顯著（P<0.01）抑制Ach、CaCl2分別對(duì)腸收縮頻率和幅度的促進(jìn)作用，抑制效果分別與硫酸阿托品和鹽酸維拉帕米相當(dāng)，而硫酸阿托品和鹽酸維拉帕米分別為常用的M 膽堿受體阻斷藥和ICa-L阻斷藥。故此說明，硬枝堿蓬多糖可能通過抑制G 蛋白耦聯(lián)M 受體介導(dǎo)的AC- cAMPPKA 和PLC-IP3-Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及Ca2+信號(hào)系統(tǒng)（如抑制肌膜ICa-L進(jìn)而抑制Ca2+- CaM 信號(hào)通路），從而抑制離體十二指腸平滑肌收縮。

Enk 也是十二指腸運(yùn)動(dòng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，屬內(nèi)源性阿片神經(jīng)肽家族的一員，主要包括Leuenk、Met-enk兩種，本課題組前期研究表明Enk是δ 阿片受體的內(nèi)源性配體［14］。通過與G 蛋白耦聯(lián)δ受體結(jié)合，Enk 可激活腸肌膜上GTP 結(jié)合蛋白［15］，使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高，激活蛋白激酶K（PKK）和Ca2+依賴性蛋白激酶C（PKC）［16］，進(jìn)而激活Ca2+信號(hào)系統(tǒng)［17］，導(dǎo)致十二指腸平滑肌收縮增強(qiáng)。TH是NE 合成的限速酶，可作為NE 能神經(jīng)元活性的標(biāo)志，TH 表達(dá)升高直接引起NE 合成增多［18］，而NE 屬于腎上腺素能β 受體激動(dòng)藥，可通過激活G蛋白耦聯(lián)β 受體介導(dǎo)的AC- cAMP- PKA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而松弛十二指腸平滑肌。ELISA 實(shí)驗(yàn)中，硬枝堿蓬多糖3個(gè)劑量組家兔離體十二指腸組織中Leu-enk 和Met-enk 含量均不同程度減少，TH 活性均不同程度升高，表明硬枝堿蓬多糖可能通過調(diào)節(jié)肌間神經(jīng)叢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的活動(dòng)而影響十二指腸運(yùn)動(dòng)。硬枝堿蓬多糖可能通過降低Leu-enk和Metenk 含量，抑制G 蛋白耦聯(lián)δ 受體介導(dǎo)的GTPcAMP-（PKK 或PKC）信號(hào)通路及Ca2+信號(hào)系統(tǒng)，從而抑制離體十二指腸收縮；并可能通過升高TH 活性引起NE 增多，再激活G 蛋白耦聯(lián)β 受體介導(dǎo)的AC-cAMP-PKA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而松弛離體十二指腸平滑肌。

綜合本研究結(jié)果可得知，多糖為硬枝堿蓬中抑制十二指腸運(yùn)動(dòng)的有效成分，作用機(jī)制可能是通過腸肌間神經(jīng)叢抑制G 蛋白耦聯(lián)M 受體介導(dǎo)的AC-cAMP-PKA 和PLC-IP3-Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及Ca2+信號(hào)系統(tǒng)（如抑制肌膜ICa-L進(jìn)而抑制Ca2+-CaM信號(hào)通路）；可能通過抑制肌間神經(jīng)叢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元釋放Leu-enk 和Met-enk，從而抑制G 蛋白耦聯(lián)δ受體介導(dǎo)的GTP-cAMP-（PKK 或PKC）信號(hào)通路及Ca2+信號(hào)系統(tǒng)；并可能通過促進(jìn)肌間神經(jīng)叢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元釋放TH引起NE增多，再激活G蛋白耦聯(lián)β受體介導(dǎo)的AC-cAMP-PKA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。硬枝堿蓬多糖有望在胃腸運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)等疾病的新藥研發(fā)中發(fā)揮作用，本研究也為拓展硬枝堿蓬臨床新用途提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。