超聲提取-氣相色譜法測定土壤1,9-癸二醇*

楊 婷，陸玉芳，馬明坤，施衛(wèi)明?

（1.中國科學院南京土壤研究所，南京 210008；2.中國科學院大學，北京 100049）

硝化作用是造成農(nóng)田氮素損失、地表和地下水源污染的主要途徑[1]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中常通過施入合成硝化抑制劑來降低土壤硝化作用，但由于成本過高、增產(chǎn)不顯著、性能不穩(wěn)定等因素未能得到廣泛應用[2-3]。由植物自身合成和分泌的生物硝化抑制劑，能在根系持續(xù)精準釋放，環(huán)境友好，效果穩(wěn)定，近年來受到廣泛關注[4-6]。1,9-癸二醇是從水稻根系分泌物中分離鑒定出的一種新型生物硝化抑制劑，可減少溫室氣體N2O的排放，具有提高農(nóng)田氮素利用率和減少溫室氣體排放的應用潛力[7-8]。硝化抑制劑在土壤中的穩(wěn)定性是影響其應用效果的重要因素之一，建立一種高效、快速、準確的提取和檢測方法是評價其作用效果穩(wěn)定性的前提，但土壤中1,9-癸二醇的提取方法未有報道，制約了1,9-癸二醇在土壤中作用效果穩(wěn)定性的評價。

土壤中有機物質(zhì)的提取方法有索氏提取法、加速溶劑萃取法、超臨界萃取、超聲波提取法等。其中，索氏提取法雖為經(jīng)典的提取方法，但由于提取效率較低、時間長、提取溶劑用量大而被一些新興提取方法替代[9]；超臨界萃取雖具有較高的提取效率，但儀器復雜且花費較高[10]；加速溶劑提取技術(shù)測定結(jié)果準確，但一次性設備投資較大[11]，因而在日常分析中這些提取技術(shù)并不普遍應用。超聲波提取技術(shù)利用超聲波高強度的聲能量，增強了提取劑的穿透能力，增大被提取成分分子的運動速率和頻率，使溶質(zhì)快速溶解于溶劑，促使提取有效、高速進行，具有提取時間短、效率高、設備花費低的特點，因而被廣泛應用于環(huán)境樣品提取[12-13]。綜合不同提取方法消耗的時間、溶劑、人工和儀器成本，超聲提取法具有明顯的應用優(yōu)勢，但超聲提取所選用的溶劑類型、溶劑體積、提取時間和提取次數(shù)等均會影響提取效率[14]，因此，超聲法提取土壤中生物硝化抑制劑1,9-癸二醇的方法有待進一步探索。

作為一種脂肪醇類化合物，1,9-癸二醇可利用氣相色譜進行定量分析。Sun等[8]利用Agilent 6890氣相色譜和Agilent 5975質(zhì)譜聯(lián)用，分離鑒定出了水稻根系分泌物中的 1,9-癸二醇，并比較了不同水稻品種根系分泌物中的含量；Zhang等[15]利用Agilent 7890對1,9-癸二醇的衍生化反應條件進行了優(yōu)化，并分析了影響水稻根系分泌該物質(zhì)的因素。隨著色譜技術(shù)的快速發(fā)展與色譜儀器的更新，Agilent 8890相比于Agilent 6890和Agilent 7890靈敏度更高，檢測限更低，可實現(xiàn)常量、微量甚至痕量樣品的檢測和定量分析，但利用Agilent 8890測定1,9-癸二醇的方法有待進一步開發(fā)。綜上，本文旨在開發(fā)土壤中1,9-癸二醇提取方法的基礎上，對氣相色譜 Agilent 8890測定1,9-癸二醇的各個參數(shù)進行優(yōu)化，從而建立一套完整的超聲波提取-氣相色譜檢測土壤中1,9-癸二醇的分析方法，為土壤中 1,9-癸二醇后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤為發(fā)育于湖積物的潴育型水稻土，土壤采集自江蘇宜興（31°16′ N，119°54′ E），理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of tested soil

1.2 儀器與試劑

化學標準品 1,9-癸二醇，定制于公司，純度大于95%，常溫下為液態(tài)黏稠物質(zhì)。有機試劑乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷為色譜純，石油醚（沸程 60～90 ℃）為分析純，均產(chǎn)自上海安譜實驗科技股份有限公司。

樣品前處理儀器為數(shù)控超聲波清洗器（XO25-12DJ，ATPIO，中國）、防腐型12位氮吹儀（EFAA-DC12-RT，ANPEL，中國）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1100D-WD，EYELA，日本）；樣品測定儀器為氣相色譜儀（Agilent 8890，美國。包括HP 8890氣相色譜、HP 7693自動進樣器，Agilent）。

1.3 氣相色譜測定1,9-癸二醇試驗設計

1.3.1 1,9-癸二醇標準溶液的配制 用色譜級正己烷準確配制1 mg·mL–1的1,9-癸二醇標準溶液，依次取 0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL的標準溶液于容量瓶中，用色譜級正己烷稀釋定容至 10 mL，即為 10.00～100.00 μg·mL–1的 1,9-癸二醇標準使用液。

1.3.2 氣相色譜測定條件優(yōu)化 采用裝備有氫火焰離子化檢測器（FID）的Agilent 8890工作站，參考Zhang等[15]利用Agilent 7890測定1,9-癸二醇的方法，初始運行參數(shù)如下：毛細管色譜柱 HP-5（25 m×0.2 mm×0.33 μm）；進樣口溫度250℃；不分流進樣；初始柱溫60℃，保持2 min，以10℃·min–1的速率升至150℃，然后以3℃·min–1的速率升至195 ℃，保持2 min，最后以20℃·min–1的速率升至270 ℃；載氣為氮氣，柱流量 1.5 mL·min–1；進樣量2 μL。在初始條件的基礎上設置進樣口溫度（200、220、240、250、260、270 ℃）、檢測器溫度（260、270、280、300、310、320 ℃）、升溫程序（表2）進行優(yōu)化。1,9-癸二醇濃度10 μg·mL–1，每個條件設置6個重復，考察以上參數(shù)的改變對其峰面積的影響。

1.4 超聲提取土壤1,9-癸二醇試驗設計

1.4.1 加標土壤樣品的制備 土壤風干研磨后過2 mm篩，稱取1.00 g于離心管中，逐滴加入配制濃度為 2 mg·mL–1的 1,9-癸二醇標準溶液 0.5 mL，參考硝化抑制劑穩(wěn)定性實驗設置[16]，將體系靜置1 h，使溶液充滿整個土壤孔隙，與土壤充分接觸但又不會發(fā)生降解轉(zhuǎn)化。該加標土壤樣品的 1,9-癸二醇濃度為1 000 mg·kg–1，并作為后續(xù)超聲提取條件優(yōu)化實驗的濃度。

1.4.2 土壤中1,9-癸二醇的超聲提取 （1）提取試劑的選擇：將上述1 000 mg·kg–1加標土壤樣品用不同提取試劑（水、乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、石油醚）進行超聲提取，每個條件設置4個加標平行樣品。液料比40 mL· g–1，超聲處理 30 min，離心（6 000 r·min–1）5 min，上清液過濾后轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，土壤殘渣按上述過程再進行兩次處理，即共提取3次。將三次提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40℃蒸發(fā)至干，殘余物用正己烷溶解，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后定容至10 mL。取適量用氣相色譜以標準曲線法測定土壤中 1,9-癸二醇含量并計算回收率，比較不同提取劑對土壤 1,9-癸二醇回收率的影響。（2）提取次數(shù)的選擇：以甲醇作為提取劑，液料比40 mL·g–1，超聲處理30 min，提取次數(shù)分別為 1次、2次、3次，其他操作步驟同1.4.2（1），比較提取次數(shù)對土壤 1,9-癸二醇回收率的影響。（3）液料比的選擇：以甲醇作為提取劑，超聲處理30 min，提取1次，液料比分別為10、20、30、40、50 mL·g–1，其他操作步驟同 1.4.2（1），比較液料比對土壤 1,9-癸二醇回收率的影響。（4）超聲時間的選擇：以甲醇作為提取劑，液料比40 mL·g–1，提取 1 次，超聲處理時間分別為 10、20、30、40、50 min，其他操作步驟同1.4.2（1），比較超聲時間對土壤1,9-癸二醇回收率的影響。

1.5 不同濃度1,9-癸二醇加標回收率試驗設計

按照 1.4.1方法配制濃度為 10、100、1 000 mg·kg–1的加標土壤，以甲醇作為提取劑超聲提取 1次，液料比40 mL·g–1，超聲時間30 min，其他操作步驟同1.4.2（1），測定不同濃度1,9-癸二醇的加標回收率。

1.6 統(tǒng)計分析

氣相色譜數(shù)據(jù)通過 Agilent Openlab Data Analysis 2.4完成，實驗數(shù)據(jù)利用 Microsoft excel 2007和SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，用最小顯著差異法（LSD）分析各處理間的差異顯著性，不同的小寫字母表示處理間有顯著差異（P<0.05）；使用Origin 2017繪制圖表，圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標準差。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜測定1,9-癸二醇條件優(yōu)化

氣相色譜進樣口溫度、檢測器溫度、升溫程序?qū)?1,9-癸二醇的響應值影響如圖1所示。物質(zhì)在氣相色譜的響應值越高，則檢測靈敏度越高，越有利于分析[12]。隨著進樣口溫度升高，1,9-癸二醇響應值逐漸升高后又有所降低，這說明當進樣口溫度較低時待測組分未完全汽化，溫度過高時物質(zhì)發(fā)生分解，從而導致 1,9-癸二醇部分損失而不利于測定，因此參考初始條件，選擇250 ℃為較適宜的進樣口溫度。檢測器溫度過低，組分分子電離數(shù)目少，產(chǎn)生電流信號小，導致靈敏度降低，過高會影響其使用壽命，一般檢測器溫度要高于組分沸點 50 ℃以上，保證流出色譜柱的組分不冷凝[17]，因此檢測器溫度310 ℃為適宜的測定條件。柱溫是影響物質(zhì)分離效果、峰形的重要因素，一般毛細管柱分析多組分時多采用程序升溫。雖升溫程序3和4均能使得1,9-癸二醇達到較高的響應值，但升溫程序3需運行31.75 min，升溫程序4運行時間僅23 min，可縮短樣品分析時間，提高測定效率。綜上，氣相色譜測定1,9-癸二醇的最優(yōu)化條件為：進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度 310 ℃，升溫程序：初始柱溫 60 ℃，保持 2 min，以 20 ℃·min–1的速率升至 150 ℃，然后以 3 ℃·min–1的速率升至 180 ℃，保持 2 min，最后以 20 ℃·min–1的速率升至 270℃。

2.2 氣相色譜儀器的精密度及標準曲線

標準曲線：依次取 10～100.00 μg·mL–1的標準使用液，并以溶劑正己烷作為參比，按最優(yōu)化條件進行測定，以 1,9-癸二醇的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，標準曲線如圖2所示。在所取濃度范圍內(nèi)，1,9-癸二醇的濃度與峰面積之間線性關系良好，線性方程y=26.81x–9.678，R2=0.999。10 μg·mL–1標準樣品的氣相色譜圖如圖3所示，色譜圖基線平穩(wěn)，1,9-癸二醇的保留時間Rt為9.895 min，且色譜峰無前延或拖尾現(xiàn)象，呈高斯對稱，峰形較好，符合色譜分析要求[17]。

儀器精密度：加標濃度為 40.00 μg·mL–1，在儀器最優(yōu)條件下，日內(nèi)和日間平行測定6次加標樣[17]，結(jié)果如表3所示，日內(nèi)精密度和日間精密度RSD<5%，說明該方法精密度良好。

表3 儀器精密度及方法檢出限、回收率Table 3 Precision，detection limit and recovery rate of the instrument

儀器檢出限：以3倍信號噪聲比對應的樣品濃度，與較低的相近濃度的標樣信號值相比較，計算得儀器的最低檢出限為 0.03 μg·mL–1。

測定方法回收率：加標量為 10 μg·mL–1，連續(xù)測定6個加標樣，按上述線性方程計算得相應目標物的測定濃度，得回收率為95.94%，符合有機樣品的分析要求。

2.3 超聲提取后土壤中1,9-癸二醇的氣相色譜圖

按照 1.4.2方法對空白土壤和添加 1 000 mg·kg–1標樣土壤中的 1,9-癸二醇進行提取，利用上述優(yōu)化的氣相色譜測定方法進行測定，氣相色譜圖如圖4所示。保留時間在9.5～10.5 min范圍內(nèi)，空白土壤的色譜圖中僅有一段平穩(wěn)的基線，未出現(xiàn)任何色譜峰，因此空白土壤中未檢測到 1,9-癸二醇；添加標樣土壤的色譜圖在該時間段內(nèi)僅出現(xiàn)一個清晰且分離度高的色譜峰，保留時間Rt為9.900 min，與標準品的保留時間（圖3，Rt為9.895 min）差異在合理的誤差范圍內(nèi)[19]，因此該峰是1,9-癸二醇的色譜峰。

除目標峰外，土壤樣品的色譜圖中也存在少量雜峰，但響應值僅為目標物響應值的 1%～3%，且超聲提取的回收率達95%，因此，雜峰對目標物定量的干擾很小。在雜質(zhì)不干擾目標物測定的情況下，不進行提取液凈化可減少淋洗液濃縮過程的損失，也可在很大程度上提高工作效率[12，20]，故本方法提取和測定方法可滿足實驗要求。

2.4 不同提取條件對土壤中 1,9-癸二醇提取效果的影響

2.4.1 提取溶劑 不同提取溶劑對 1 000 mg·kg–1加標土壤中 1,9-癸二醇的提取結(jié)果如圖5所示。由于 1,9-癸二醇屬于脂溶性極性化合物，根據(jù)相似相溶原理，利用非極性溶劑石油醚、正己烷提取的回收率較低，分別為44.6%和52.4%，水對1,9癸二醇的提取回收率為 77.8%，極性有機溶劑如乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷等提取回收率較高，可達到93%～96%，因此，極性有機溶劑提取土壤中的1,9-癸二醇效果更好?？紤]到以上極性有機溶劑中甲醇的毒性和成本較低，選擇甲醇作為提取劑。

2.4.2 提取次數(shù) 1 000 mg·kg–1加標土壤經(jīng)不同次數(shù)超聲提取后 1,9-癸二醇的回收率結(jié)果如表4所示。以甲醇作為提取劑，超聲提取一次后土壤中1,9-癸二醇的回收率已達到 92.5%，再進行二次提取和三次提取后回收率并無顯著上升，說明經(jīng)過一次超聲提取后物質(zhì)的溶出已經(jīng)趨近飽和，多次提取僅是消耗更多的提取劑，提取和濃縮時間也會加長。因此，為節(jié)約溶劑、縮短樣品處理時間，確定最適提取次數(shù)為1次。

表4 提取次數(shù)對1,9-癸二醇回收率的影響Table 4 Recovery rate of 1,9-decanediol relative to extraction frequency

2.4.3 液料比 液料比是指提取劑體積與土壤質(zhì)量的比值。不同液料比對1 000 mg·kg–1加標土壤中1,9-癸二醇的提取結(jié)果如圖6所示。當超聲提取一次，液料比從 10 mL·g–1增加至 40 mL· g–1時，回收率從 79.3%提高至 95.3%，這說明液料比的擴大可增加土壤與提取劑的接觸面積，使得目標物 1,9-癸二醇更充分地溶解出來[21]，而液料比增加至50 mL·g–1后，回收率并無明顯變化，但會造成溶劑的浪費，增加樣品的濃縮時間，因此為減少提取劑對環(huán)境的負面效應、降低實驗成本、提高實驗效率，確定最佳液料比為 40 mL·g–1。

2.4.4 超聲時間 不同超聲時間對 1 000 mg·kg–1加標土壤中 1,9-癸二醇的提取結(jié)果如圖7所示。超聲時間的長短直接影響溶劑與土壤的接觸程度，從而影響提取效率[22]。超聲時間從 10 min增加至30 min時，1,9-癸二醇的回收率從 85.1%上升至90.74%，再延長超聲時間至 40 min時，回收率（91.07%）略有上升，但與超聲 30 min相比無顯著差異。超聲時間超過 40 min后，1,9-癸二醇的提取效率反而下降，這可能是由于隨著超聲時間的增長，一方面超聲過程產(chǎn)生的·OH和·H自由基濃度增大，另一方面在空化過程中形成的超臨界態(tài)水的氧化作用逐漸增強[23]，因此推測 1,9-癸二醇結(jié)構(gòu)被破壞或者發(fā)生氧化降解，該結(jié)果與超聲提取大豆蛋白[24]、果膠[25]、土壤中除草劑[26]等的結(jié)果相似，超聲提取時間過長造成一些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等發(fā)生變化。因此，綜合考慮回收率和樣品處理時間成本，超聲提取時間控制在30 min即可。

綜合上述結(jié)果，確定超聲波提取土壤 1,9-癸二醇的最佳參數(shù)為：以甲醇作為提取劑超聲提取1次，液料比 40 mL·g–1，超聲時間 30 min。

2.5 不同濃度1,9-癸二醇的加標回收率

為了驗證本實驗方法的可靠性，設置10、100、1 000 mg·kg–1三個土壤樣品的加標濃度。設置依據(jù)如下：在水培體系下，不同品種水稻根系分泌 1,9-癸二醇含量 0～10 μg·g–1DW d–1[8]，推算至根際土壤中 1,9-癸二醇的濃度范圍為 0～60 mg·kg–1[7]，因此設置 10 mg·kg–1加標濃度作為土壤中 1,9-癸二醇的自然濃度水平（低濃度水平）。根際微域環(huán)境的改變?nèi)鐫舛?、?pH、氧氣等均能顯著促進生物硝化抑制劑的分泌，使其分泌量提高2～10倍[15，27-28]，因此設置100 mg·kg–1為中濃度水平（低濃度水平的10倍）。根系分泌物在特定條件下會呈現(xiàn)脈沖式地突然增加[4，29]，設置 1 000 mg·kg–1為 1,9-癸二醇的加標高濃度水平（低濃度水平的100倍）。而且，本研究設置的 1,9-癸二醇加標高濃度水平 1 000 mg·kg–1也在生物硝化抑制劑在土壤中起作用的濃度范圍內(nèi)，一些生物硝化抑制劑如亞麻酸、亞油酸的土培添加濃度為 1 000 mg·kg–1、對羥基苯丙酸甲酯（MHPP）的土培添加濃度為 2 000 mg·kg–1時，土壤硝化作用可被顯著抑制[30-31]，Lu等[7]的研究表明，500～1 000 mg·kg–1的 1,9-癸二醇可顯著抑制土壤的硝化作用，減少N2O的排放。

將不同加標濃度的土壤樣品按照 2.2.5所示最優(yōu)參數(shù)超聲提取，并測定提取液中1,9-癸二醇的含量，計算加標回收率，結(jié)果如表5所示。當土壤中1,9-癸二醇濃度添加從 10 mg·kg–1擴大至 100 mg·kg–1、1 000 mg·kg–1時，回收率并未發(fā)生大幅度的波動，平均值分別為90.58%、93.25%、94.55%，且變異系數(shù)CV均小于5%，說明該方法提取水稻土中的1,9-癸二醇的結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復性好。由于不同類型土壤的pH、總有機碳含量、陽離子交換量等理化性質(zhì)不同，待提取目標物質(zhì)與土壤有機質(zhì)的結(jié)合能力、在提取體系的存在形式等可能有所不同[32]。然而研究表明，當用甲醇、乙酸乙酯等有機溶劑提取時，有機溶劑對不同土壤中目標物質(zhì)的提取效率類似。生弘杰等[33]利用乙酸乙酯提取磚紅壤和黃棕壤中的?；呓z氨酸內(nèi)酯C7-HSL的回收率分別為87.90%和85.82%；賀仲兵[34]用甲醇提取紅壤和潮土中溴硝醇的回收率分別為90.66%、90.44%。這可能是因為溶劑效應強于土壤表面顆粒對物質(zhì)的吸引力，促使其與土壤表面結(jié)合鍵的斷開[35]。由此推測，本研究中利用有機溶劑甲醇超聲提取土壤中 1,9-癸二醇的方法也可能適用于不同類型土壤。

表5 不同濃度1,9-癸二醇的加標回收率Table 5 Spike recovery rate of 1,9-decanediol relative to concentration

3 結(jié) 論

環(huán)境友好的生物硝化抑制劑已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中氮肥減施增效的一項新技術(shù)。為了評價生物硝化抑制劑在土壤中的應用效果，迫切需要發(fā)展簡便快速的提取和檢測技術(shù)。本文建立了一種超聲波提取-氣相色譜檢測土壤中 1,9-癸二醇的方法：以甲醇作為提取劑超聲提取 1次，液料比 40 mL·g–1，提取30 min；氣相色譜Agilent 8890 進樣口溫度250℃，F(xiàn)ID檢測器溫度310℃，初始柱溫60℃，保持2 min，以 20℃·min–1升至 150℃，然后以 3℃·min–1升至180 ℃，保持 2 min，最后以 20℃·min–1升至 270℃。該方法操作簡便、快速高效、回收率高、重復性好。隨著今后土壤中根系分泌物原位收集和檢測技術(shù)的發(fā)展，以及 1,9-癸二醇作為綠色氮肥增效劑在農(nóng)業(yè)中的應用，該方法將為農(nóng)業(yè)土壤中 1,9-癸二醇的穩(wěn)定性和環(huán)境效應等評價奠定基礎，也為土壤中其他生物硝化抑制劑提取方法的建立提供參考和借鑒。