卵巢癌與宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)變異及意義

郝佳星,彭真,鄒淑花

(青島大學(xué)附屬青島市婦女兒童醫(yī)院,山東 青島 266034)

拷貝數(shù)變異是后基因組時(shí)代被逐漸認(rèn)識(shí)到的腫瘤性疾病特征性改變。人類基因組有眾多頻率、強(qiáng)度不等的重復(fù)序列，而拷貝數(shù)變異被定義為涉及范圍從1 kb到數(shù)Mb不等的基因片段的刪除、插入、復(fù)制及多位點(diǎn)變異的改變類型[1-2]。目前研究認(rèn)為，拷貝數(shù)變異不僅是個(gè)體遺傳差異的基礎(chǔ)，也在體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移定植中發(fā)揮著重要作用，拷貝數(shù)變異相關(guān)指標(biāo)或可成為理想的腫瘤診斷標(biāo)志物。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT是經(jīng)典的腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，PI3K/AKT通路的高活化與多種腫瘤凋亡抑制、侵襲轉(zhuǎn)移及促血管生成密切相關(guān)，而PI3K是該通路的關(guān)鍵分子[3]。在哺乳動(dòng)物中編碼催化PI3K亞基的8種基因中，只有編碼普遍表達(dá)的p110α催化亞基的PIK3CA常有高突變率[4]。突變的PIK3CA持續(xù)活化，上調(diào)PI3K/AKT通路水平進(jìn)而參與腫瘤發(fā)生。既往已有較多關(guān)于結(jié)直腸癌、乳癌中PIK3CA突變及拷貝數(shù)變異的研究報(bào)道，而PIK3CA在卵巢癌、宮頸癌等婦科腫瘤中研究并不多見[3]。本文借助癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，將臨床樣本數(shù)據(jù)與RNA-Seq數(shù)據(jù)相結(jié)合，探討PIK3CA基因拷貝數(shù)異常在卵巢癌、宮頸癌中的表型及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以期為卵巢癌及宮頸癌惡性進(jìn)展機(jī)制研究及診斷提供思路[5]。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

相關(guān)數(shù)據(jù)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站中下載獲取，檢索TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)宮頸癌及卵巢癌的 Illumina HiSeq_RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)并進(jìn)行打包整理。

1.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.1納入研究樣本數(shù)量 在TCGA可視化數(shù)據(jù)庫(kù)cBioPortal(https://www.cbioportal.org)中選擇Ovary/Fallopain Tube→Ovarain Epithelial Tu-mor→Ovarain Serous Adenocarcinoma(TCGA, Pan Cancer Atlas)，共獲得了201例符合要求的研究樣本；選擇Cervix→Cervical Squamous Cell Carcinoma(TCGA, Pan Cancer Atlas),共獲得275例符合要求的研究樣本。

1.2.2病人總體樣本及PIK3CA基因的拷貝數(shù)擴(kuò)增分析 分別選擇Mutations;Putative copy-number alteration from GISTIC;mRNA Expression Zscores,RSEM(Batch normalized from Illumina HiSeq_RNASeqV2)。選擇完畢后提取mRNA表達(dá)矩陣，運(yùn)用R語(yǔ)言的R Bioconductor/DESeq2、ggplot等軟件包進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并進(jìn)行可視化作圖。

1.2.3病理特征分析 在所獲取樣本中，二次檢索宮頸癌及卵巢癌病人中PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增病人與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者的臨床信息，分別收集具有完整病史及臨床病理診斷結(jié)果等臨床信息的卵巢癌及宮頸癌病人。

1.2.4卵巢癌、宮頸癌腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路生物信息學(xué)發(fā)掘 根據(jù)RNA-Seq數(shù)據(jù)表達(dá)矩陣的矩陣分組，比較卵巢癌、宮頸癌PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增病人與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者的基因差異，差異基因表達(dá)分析的數(shù)據(jù)要求先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以避免誤差。所獲得的數(shù)據(jù)使用軟件edgeR(3.12.1)R Bioconductor包進(jìn)行解析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用功能分析(Gene Ontology, GO)方法及通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)并富集分析差異基因功能。

1.2.5生存分析 采用Kaplan-Meier及Cox模型對(duì)所獲得的樣本進(jìn)行生存分析，對(duì)結(jié)果進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組病人PIK3CA基因的拷貝數(shù)擴(kuò)增情況

在納入的卵巢癌201例研究樣本中，對(duì)17個(gè)基因的擴(kuò)增情況進(jìn)行分析，擴(kuò)增前5位的基因分別為PIK3CA(55%，110/201)、PRKCI(48%，96/201)、MYC(41%，82/201)、MECOM(35%，70/201)和KRAS(33%，66/201)，其病理分型均為卵巢上皮性腫瘤。在納入的宮頸癌275例研究樣本中，對(duì)17個(gè)基因的擴(kuò)增情況進(jìn)行分析，擴(kuò)增前5位的基因分別為PIK3C(62%，170/275)、PRKCI(36%，99/275)、EIF5A2(28%，77/275)、MECOM(19%，52/275)和AKT2(19%，52/275)；病理分型中宮頸鱗狀細(xì)胞癌占84.5%，宮頸腺癌占8.8%，宮頸黏液腺癌占5.7%，子宮內(nèi)膜樣癌占1.0%。病人總體樣本17個(gè)基因拷貝數(shù)擴(kuò)增分布見圖1、2。

2.2 卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人的臨床及病理特征

在納入的201例卵巢癌研究樣本中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增110例；在納入的275例宮頸癌研究樣本中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增170例。對(duì)PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人的臨床及病理特征分析顯示，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增在卵巢癌及宮頸癌41～60歲年齡病人占比最高，均超過50%。在卵巢癌病人中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異病人腫瘤各病理分級(jí)比例接近，其中病理分級(jí)為3級(jí)者占比均超過80%，而且PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人的病死率(50.91%)明顯高于不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者(39.56%)。而在宮頸癌病人中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人高級(jí)別病理分級(jí)占比(32.94%)明顯低于不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者(53.33%)，而PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人的病死率(20.49%)低于不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者(24.76%)。PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增影響卵巢癌病人病死率，而在宮頸癌病人中對(duì)腫瘤的病理分級(jí)具有顯著影響。見表1。

表1 卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人臨床病理特征(例(χ/%))

2.3 PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增與預(yù)后相關(guān)性

生存分析顯示，卵巢癌病人不攜帶PIK3CA基因拷貝數(shù)變異病人的無(wú)病生存期和總生存期長(zhǎng)于PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增者，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)；宮頸癌病人不攜帶PIK3CA基因拷貝數(shù)變異者與PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增者的總生存期與無(wú)病生存期無(wú)明顯差異(P>0.05)。見圖3、4。

2.4 宮頸癌及卵巢癌病人中的生物信息學(xué)分析

KEGG分析表明，宮頸癌及卵巢癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異病人所激活的信號(hào)通路類似，PIK3CA基因所參與的較為有關(guān)聯(lián)性的信號(hào)通路見圖5。對(duì)PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者的差異基因進(jìn)行比較，結(jié)果顯示PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增可能會(huì)引起一些基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的變化，從而激活下游一些信號(hào)通路。PIK3CA的激活可參與調(diào)節(jié)第二信使PIP3的傳導(dǎo)以及PI3K磷酸化，激活PI3K-AKT信號(hào)通路。KEGG富集分析表明，在宮頸癌及卵巢癌病人中，PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄失調(diào)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對(duì)差異基因數(shù)目大于100的通路進(jìn)行GO分析顯示，細(xì)胞內(nèi)的三大板塊生物進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞組分很多方面均受到顯著影響。見圖6、7。

3 討 論

隨著腫瘤生物學(xué)研究的深入，人們對(duì)腫瘤的認(rèn)知深入到了分子水平。目前就腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及進(jìn)展機(jī)制，最廣泛被接受的是“突變致癌”學(xué)說[6-7]?；蚩截悢?shù)變異是一種常見的基因多位點(diǎn)突變形式，其可影響腫瘤的生物學(xué)表型及異質(zhì)性，驅(qū)動(dòng)腫瘤復(fù)雜性生長(zhǎng)。卵巢癌、宮頸癌均是極為常見的婦科惡性腫瘤[8-10]。開發(fā)出理想的實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)志物，對(duì)卵巢癌和宮頸癌早期診斷、明確腫瘤分期進(jìn)而制定正確治療方案及改善病人預(yù)后均有重大意義[11-13]。

腫瘤細(xì)胞中存在著多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常表達(dá)，PI3K/AKT為其中常見的通路之一。PI3K是影響該通路表達(dá)水平的決定性分子[14]，PI3K的持續(xù)活化常預(yù)示著腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。PI3K為異源二聚分子，其基本結(jié)構(gòu)由一個(gè)起催化作用的PI3KC亞基和一個(gè)起調(diào)節(jié)作用的PI3KR亞基組成，而PI3KC亞基又由PI3KCA、PI3KCB等亞單位構(gòu)成[15-16]。其中，PI3KCA分子結(jié)構(gòu)的改變常導(dǎo)致PI3K持續(xù)激活，上調(diào)PI3K/AKT水平進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[17]。

本文的研究結(jié)果顯示，卵巢癌以及宮頸癌病人PIK3CA基因均有顯著的擴(kuò)增，其占比分別為55%和62%；宮頸癌病人PIK3CA基因擴(kuò)增最多的為鱗狀細(xì)胞癌(84.5%)，而卵巢癌病人病理類型均為卵巢漿液性上皮腫瘤，提示PIK3CA基因擴(kuò)增檢測(cè)有助于卵巢腫瘤的鑒別診斷。本文研究對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及cBioPortal網(wǎng)站檢索到的卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人的臨床數(shù)據(jù)與表達(dá)矩陣分析顯示，相較于正常人群[18]，PIK3CA基因在卵巢癌及宮頸癌病人中擴(kuò)增率與拷貝數(shù)變異增加明顯；同時(shí)，卵巢癌及宮頸癌病人PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人中41～60歲所占比例均超過50%；卵巢癌病人中，病理分級(jí)3級(jí)比例最高，而宮頸癌病人PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人病理分級(jí)中、高級(jí)別比例接近。從臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看[19]，或許PIK3CA突變可作為卵巢癌病理分型的依據(jù)，但具體價(jià)值需要進(jìn)一步的臨床研究。本文結(jié)果還顯示，卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人與不攜帶PIK3CA拷貝數(shù)變異者的病死率不同，可能與本文樣本量不夠大有關(guān)，結(jié)論有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本文生存分析顯示，卵巢癌病人中不攜帶PIK3CA拷貝數(shù)變異的病人總生存期與無(wú)瘤生存期可能更長(zhǎng)，PIK3CA拷貝數(shù)變異可能預(yù)示不良結(jié)局；對(duì)宮頸癌而言，并無(wú)證據(jù)證實(shí)PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增和病人不良結(jié)局有關(guān)。

本文KEGG與GO分析結(jié)果顯示，PI3K-AKT信號(hào)通路在正常的生理狀況下能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，PIK3CA擴(kuò)增或突變會(huì)引起轉(zhuǎn)錄調(diào)控失活，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[20]。PIK3CA的激活可參與調(diào)節(jié)第二信使PIP3的傳導(dǎo)以及PI3K磷酸化，激活PI3K-AKT信號(hào)通路。其中PTEN磷酸酶活性增加可以被氧化應(yīng)激反應(yīng)激活，而AKT磷酸化的變化會(huì)引起其下游蛋白的變化，包括下游凋亡、細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等相關(guān)基因蛋白的表達(dá)變化。在卵巢癌病人中，PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增除了影響上述信號(hào)通路外，還影響內(nèi)分泌抵抗信號(hào)通路。這預(yù)示著PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增對(duì)卵巢癌病人的影響作用更加廣泛，生物功能更為多樣。

有富集分析結(jié)果顯示，PIK3CA擴(kuò)增和多種細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)，主要影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和維持、凋亡以及信號(hào)傳導(dǎo)等過程以及基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置[20]，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核或蛋白酶體等也受到顯著影響，如包括細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞的蛋白質(zhì)定位等。此外，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究可以幫助我們找到更加復(fù)雜詳細(xì)的基因蛋白互作網(wǎng)路，了解下游基因蛋白的類型與功能。PIK3CA基因作為一種重要的癌基因，對(duì)其進(jìn)行深入研究將為闡述腫瘤的分子發(fā)生機(jī)制、早期診斷、病理監(jiān)測(cè)、腫瘤生物學(xué)行為判斷、預(yù)后評(píng)估提供豐富的臨床資料。

綜上所述，PIK3CA基因在卵巢癌及宮頸癌中具有特征性的拷貝數(shù)改變，PIK3CA基因突變與卵巢癌、宮頸癌惡性轉(zhuǎn)化及進(jìn)展密切相關(guān)。對(duì)卵巢癌、宮頸癌拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)進(jìn)行深入探索及綜合分析，可為婦科惡性腫瘤標(biāo)志物開發(fā)、分子病理分型及制定個(gè)體化治療策略提供思路。