安神益智合劑對(duì)力竭游泳小鼠抗疲勞作用的機(jī)制

彭曉明，霍仕霞，高 莉，斯拉甫·艾白*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)中心血站，烏魯木齊 830000)

疲勞是一種日常普遍存在、涉及多種生理生化因素的疾病狀態(tài)，是機(jī)體腦力或體力到達(dá)一定程度必然出現(xiàn)的生理現(xiàn)象。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)顯示，全球約有超過35%以上的人群處于疲勞狀態(tài)，其中中年男性人群疲勞狀態(tài)達(dá)到60%。

目前抗疲勞藥物或保健品多為大腦皮層興奮類，如咖啡因、?；撬帷⒈奖泛瓦呒柞サ?。安神益智合劑由干姜、黑胡椒、蓽茇、肉桂、余甘子、毛訶子肉、白花丹、廣防己、中亞白及、奶桃、白皮松子仁、洋甘菊和紅葡萄干等藥材制成，是經(jīng)典的民族藥復(fù)方制劑，臨床主治失眠，本研究參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中緩解體力疲勞功能檢驗(yàn)方法制備小鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)性疲勞模型[1]，觀察安神益智合劑對(duì)力竭游泳小鼠的抗疲勞作用及其可能機(jī)制。

為了確保會(huì)計(jì)人員的繼續(xù)教育質(zhì)量，做到管理、考核、培訓(xùn)有效分離。通過構(gòu)建社會(huì)中介組織來監(jiān)督、檢查、考核培訓(xùn)單位的教學(xué)質(zhì)量和教學(xué)場(chǎng)所以及師資配備情況。在進(jìn)行會(huì)計(jì)員考核過程中，除了培訓(xùn)單位對(duì)會(huì)計(jì)人員進(jìn)行考核之外，企業(yè)還應(yīng)定期對(duì)會(huì)計(jì)人員進(jìn)行上崗考核，每年的繼續(xù)教育培訓(xùn)或新政策出臺(tái)之后，都要對(duì)會(huì)計(jì)人員進(jìn)行考核，只有取得合格證書的人員才能在企業(yè)工作，對(duì)于考核不合格的會(huì)計(jì)人員，進(jìn)行警告，警告后考核仍然不達(dá)標(biāo)，吊銷其會(huì)計(jì)資格證書。在培訓(xùn)單位參加培訓(xùn)的會(huì)計(jì)人員，必須建立完善的學(xué)習(xí)檔案，及時(shí)了解會(huì)計(jì)人員參與培訓(xùn)的動(dòng)態(tài)，切實(shí)提升其培訓(xùn)效果。

1 儀器與材料

1.1儀器 XD-101 型倒置顯微鏡(中國(guó)江南光電有限公司)；BIO-RAD550 型酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂公司)；BECKMAN型高速低溫離心機(jī)，Gene Amp PCR儀，均購(gòu)自美國(guó) PE 公司；BS224S型電子天平 [賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；DYCP-31CN 型瓊脂糖水平電泳儀，DYY-6D型垂直電泳儀，均購(gòu)自北京六一儀器廠； RNA/DNA 檢測(cè)儀(Pharmacia Biotech公司)；3500R型凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)；ST-I型半干式轉(zhuǎn)移電泳槽(大連竟邁生物科技有限公司)。

1.2試藥 安神益智合劑水提物(批號(hào)20160910)，自制。干姜(批號(hào)20141020)、黑胡椒(批號(hào)20150902)、蓽茇(批號(hào)20140323)、肉桂(批號(hào)20150611)、余甘子(批號(hào)20140919)、毛訶子肉(批號(hào)20151002)、白花丹(批號(hào)20150930)、廣防己(批號(hào)20140721)、中亞白及(批號(hào)20140611)、奶桃(批號(hào)20140603)、白皮松子仁(批號(hào)20150118)、洋甘菊(批號(hào)20150421)、紅葡萄干(批號(hào)20141223)等藥材，均購(gòu)自新疆和田麥迪森維藥有限公司，經(jīng)霍仕霞主任鑒定為正品。諾迪康膠囊(批號(hào)160305)，四川諾迪康威光制藥有限公司。乳酸(LD)測(cè)試盒(批號(hào)20161104)、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒(批號(hào)20161101)、血尿素氮(BUN)測(cè)試盒(批號(hào)20161018)、小鼠睪酮(T)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)20161123)、小鼠皮質(zhì)酮(C)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)20161123)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Trizol、TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒以及DNA Marker、PCR Master Mix、Taq酶，均購(gòu)自北京天根生物科技有限公司。

1.3動(dòng)物 雄性清潔級(jí)ICR小鼠60只，體質(zhì)量為16～20 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：65000700000630)，溫度為20～22 ℃，每12 h明暗交替1次，適用性飼養(yǎng)2～3 d。

2.2動(dòng)物分組及給藥方法 將60只ICR小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(諾迪康0.28 g·kg-1)和安神水提物低、中、高劑量(0.108 2、0.540 1、1.082 0 g·kg-1)組，每組10只。連續(xù)口服給藥14 d。正常組小鼠不做處理，模型組給予等體積的蒸餾水。所有藥物均以蒸餾水混懸配制，給藥期間，小鼠自由飲水和攝食，每隔3 d稱定1次體質(zhì)量。

1.4引物 利用Oligo 6.0和Primary Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因CYP11A1、CYP17A1引物。CYP11A1：上游5′-TTC CTT TGA GTC CAT CAG CA-3′，下游5′-CAC TGG TGT GGA ACA TCT GG-3′；CYP17A1：上游5′-TGG TCA TAT GCA TGC CAA CT-3′，下游5′-CCC TTC TTC ACG AGC ACT TC-3′，實(shí)時(shí)定量PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

體育游戲教學(xué)法作為一種新穎的教學(xué)方法，對(duì)學(xué)生的興趣產(chǎn)生了極大的影響，它能夠有效地將老師和學(xué)生結(jié)合在一起，保證學(xué)生始終都能以最積極的狀態(tài)來接受每一項(xiàng)教學(xué)內(nèi)容。教師作為游戲教學(xué)法的組織者和實(shí)施者，要積極的引導(dǎo)學(xué)生適應(yīng)這種教學(xué)方法，盡量做到根據(jù)每個(gè)學(xué)生的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)適合的體育游戲活動(dòng)，充分發(fā)揮學(xué)生的主觀能動(dòng)性，在促進(jìn)學(xué)生增強(qiáng)身體素質(zhì)的同時(shí)也要注重學(xué)生德智體全面發(fā)展。

2 方法

總之，現(xiàn)代企業(yè)為實(shí)現(xiàn)持續(xù)發(fā)展目標(biāo)并獲得更大經(jīng)濟(jì)效益，做好財(cái)務(wù)預(yù)算編制管理與執(zhí)行管理工作是基礎(chǔ)，對(duì)業(yè)務(wù)運(yùn)營(yíng)模式進(jìn)行合理規(guī)劃，最終實(shí)現(xiàn)預(yù)設(shè)的財(cái)務(wù)管理目標(biāo)。應(yīng)嚴(yán)格落實(shí)財(cái)務(wù)預(yù)算編制流程并加強(qiáng)對(duì)相關(guān)部門的管理，進(jìn)而為預(yù)算編制工作有效開展奠定基礎(chǔ)。并加強(qiáng)預(yù)算的執(zhí)行情況，建設(shè)相關(guān)制度或體制或加強(qiáng)人員培訓(xùn)等，為預(yù)算目標(biāo)早日實(shí)現(xiàn)貢獻(xiàn)力量。

Application of a bias correction scheme for 2-meter temperature levels over complex terrain

2.3小鼠力竭游泳時(shí)間測(cè)定 小鼠末次給藥30 min后，除正常組外，其余小鼠均在距尾根部1 cm處負(fù)荷5%體質(zhì)量的鉛皮，將其置于體積為37 cm×37 cm×50 cm、水深4 cm、水溫為24～26 ℃的游泳箱中游泳。放于水中后立即計(jì)時(shí)，至小鼠頭部沒入水面10 s不浮出，即為小鼠力竭游泳時(shí)間。

孟導(dǎo)把這個(gè)小疑問暫時(shí)拋在腦后，急忙發(fā)問：“既然是乾隆年間的古錢，再怎么也有幾百年了吧，怎么就不值錢？”

2.1安神益智合劑水提物的制備 將干姜、黑胡椒、蓽茇、肉桂、余甘子、毛訶子肉、白花丹、廣防己、中亞白及、奶桃、白皮松子仁、洋甘菊和紅葡萄干藥材按照處方比例混合并研成粗粉后，加入10倍量水浸泡30 min，回流提取2次，每次2 h，提取液過濾濃縮后，干燥成浸膏，即得安神益智合劑水提物(每克含生藥17.329 mg，簡(jiǎn)稱安神水提物)。

3.1對(duì)小鼠體質(zhì)量變化的影響 見表1。由表1可知，各組小鼠0、3、6、9、12、14 d的體質(zhì)量比較無(wú)明顯變化(P>0.05)。

2.6CYP11A1、CYP17A1的蛋白表達(dá) 稱取小鼠肌肉組織0.02 g，利用Inventbiotech離心柱法提取肌肉組織中的總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，并將各組蛋白濃度調(diào)整為一致。提取的蛋白加入Loading buffer，并在沸水浴中變性5 min，在100 g·L-1的SDS-PAGE膠中進(jìn)行蛋白電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白移至PVDF膜上，分別將CYP11A1、CYP17A1與PVDF膜溫育過夜，用TBST洗滌3次，每次15 min，加入HRP鏈接的二抗在37 ℃溫育1 h，用TBST洗滌3次，在暗室將熒光劑A液(4克雙草酸酯與50 mL鄰苯二甲酸二丁酯置于錐形瓶中，水浴使溶解后，冷卻后即得)、B液(30 mL叔丁醇與20 mL體積分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫混合，加入微量水楊酸，混合即得)，立即加到膜上0.8 mL，混勻液體，反應(yīng)1 min，吸去多余熒光劑，將膜固定到曝光盒中，蓋緊盒蓋，曝光0.5～5 min；在顯影液、定影液中顯影和定影；比照曝光板上的膜記錄Marker和各條帶的位置，凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶[4]。

2.4相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè) 各組小鼠力竭游泳結(jié)束30 min后，摘眼球采血，分離血清，測(cè)定LD、LDH、BUN含量和睪酮/皮質(zhì)酮(T/C)比值。解剖取肝臟和腓腸肌，經(jīng)生理鹽水漂洗后，用濾紙吸干，測(cè)定肝糖原和肌糖原含量[2-5]。

3 結(jié)果與分析

2.5CYP11A1、CYP17A1的基因轉(zhuǎn)錄 稱取小鼠肌肉組織0.1 g，利用Trizol法提取肌肉組織中的RNA，電泳驗(yàn)證RNA的完整性。通過TAKARA公司的AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用QIAquick PCR Purification Kit進(jìn)行cDNA純化。將純化cDNA按照1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍濃度做梯度稀釋，使用Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG試劑進(jìn)行Realtime PCR(Bio-Rad CFX96)生成CYP11A1和CYP17A1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。定量表達(dá)結(jié)果依據(jù)CT數(shù)值，根據(jù)2-△△CT法，計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。2-△△CT=[(CT目的基因-CT內(nèi)部對(duì)照)]樣本A-[(CT目的基因-CT內(nèi)部對(duì)照)]樣本B[4]。

表1 小鼠體質(zhì)量的變化

?M.Sebastiano Erizzo.Discorso sopra le medaglie degli antichi：con la dichi aratione delle monete consulari e delle medaglie degli Imperadori Romani,Venice (Varisco&Paganini),1559;Trattato di messer Sebastiano Erizzo,dell'istrumento et via inventeur de gli antichi,Venice,1554.

表2 小鼠力竭游泳的時(shí)間

3.3對(duì)力竭小鼠血清中LD、LDH、BUN含量和T/C比值的影響 見表3。由表3可知，與正常組比較，模型組小鼠血清中T/C比值顯著降低(P<0.01)，而LD、LDH和BUN含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，安神水提物各劑量組小鼠血清中T/C比值顯著升高(P<0.01)，安神水提物低、中劑量組小鼠血清中LD和BUN含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，安神水提物各劑量組小鼠血清中LDH含量均顯著降低(P<0.01)。

3.2對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響 見表2。由表2可知，除正常組外，其他各組均進(jìn)行一次性力竭游泳。與模型組比較，安神水提物中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均可顯著延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間(P<0.05，P<0.01)。

表3 安神水提物對(duì)力竭游泳小鼠血清LD、LDH、BUN含量和T/C比值的影響

3.4對(duì)力竭小鼠肌糖原、肝糖原含量的影響 見表4。由表4可知，與正常組比較，模型組小鼠肝糖原和肌糖原含量均顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，安神水提取物中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的肝糖原含量顯著升高(P<0.01)，安神水提取物各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肌糖原均顯著升高(P<0.05，P<0.01)。

表4 安神水提物對(duì)力竭小鼠肌糖原、肝糖原含量的影響