基于網(wǎng)絡(luò)藥理學研究復方銀花解毒顆粒抗新型冠狀病毒的潛在機制

張冬玲，何樞衡，吳建雄，劉 存，張雨茜，劉光大，張評滸*

(1.億帆醫(yī)藥股份有限公司，杭州 310000；2.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點實驗室，轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院，揚州大學醫(yī)學院，揚州 225009)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠狀病毒感染引發(fā)的急性呼吸道傳染病，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳，嚴重者可出現(xiàn)呼吸困難、呼吸窘迫綜合征或膿毒癥休克等。針對此疾病目前尚無特效藥物，但根據(jù)我國前期的臨床診療實踐研究表明，基于古代中醫(yī)辨證論治“時行瘟疫”的思想采用中藥或中成藥對COVID-19不同證型進行對癥治療具有一定療效。其中基于漢代張仲景的“麻杏石甘湯”與清代吳鞠通的“銀翹散”組方而成的金花清感顆粒、清肺排毒湯等在臨床治療輕癥以及防止輕癥向重癥轉(zhuǎn)化方面具有一定作用。因此，基于病毒的復制特點及感染引發(fā)細胞因子風暴誘發(fā)急性肺損傷與急性呼吸窘迫癥(ARDS)的致病機制，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探討此類方劑在臨床治療COVID-19中的潛在機制，對指導此類方劑的研發(fā)及其臨床應(yīng)用將具有非常重要的意義。

復方銀花解毒顆粒是以“銀翹散”為基礎(chǔ)化裁而來，是臨床常用于治療普通感冒和流感的中成藥處方，曾在2003年作為安徽省治療非典型性肺炎(SARS)的預防和治療用藥，2020年為安徽省用于治療COVID-19的推薦用藥[1-2]。復方銀花顆粒由青蒿、金銀花、荊芥、薄荷、野菊花、大青葉、連翹、鴨跖草、前胡、淡豆豉10味藥材制成，臨床研究表明，此藥對流感病毒感染引起的病毒性肺炎具有良好的療效[3-6]。本文以復方銀花解毒顆粒主要成分為基礎(chǔ)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法通過“成分-靶點”的關(guān)聯(lián)性分析其治療COVID-19的潛在作用及機制，進而采用體外細胞模型驗證其抗冠狀病毒的藥效作用，以期為該藥的臨床推廣應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫和分析軟件 數(shù)據(jù)庫包括中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP (http://Lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；Pubchem有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；Swiss Target prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) 數(shù)據(jù)庫；Chemspider (http://www.chemspider.com)化合物結(jié)構(gòu)式查詢數(shù)據(jù)庫；Genecards (https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫；PANTHER (http://pantherdb.org) 數(shù)據(jù)庫；STRING (https://string-db.org) 數(shù)據(jù)庫；KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫。使用的軟件有Cytoscape 3.7.2軟件等。

1.2成分篩選以及參數(shù)設(shè)定 本研究所采用的成分均是從TCMSP數(shù)據(jù)庫中查詢獲得。輸入“青蒿”、“金銀花”、“荊芥”、“薄荷”、“野菊花”、“大青葉”、“連翹”、“鴨跖草”、“前胡”、“淡豆豉”搜索藥材成分。本項研究中以口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)為指標篩選活性成分，并最終以有明確簡化分子線性輸入規(guī)范號(smiles號)及預測靶點的化學成分作為活性成分參與網(wǎng)絡(luò)藥理學分析[7]。

1.3疾病靶點的獲取 本研究針對COVID-19預測靶點以Genecards數(shù)據(jù)庫作為主要來源，并通過搜索COVID-19相關(guān)的治療靶點及其相關(guān)文獻的對比分析，建立治療COVID-19有潛在作用的已知靶點信息表。

1.4化合物的靶點預測 本文采用Swiss Target prediction數(shù)據(jù)庫預測主要活性成分的主要作用靶點，即首先利用Pubchem和Chemspider數(shù)據(jù)庫導出化合物SDF或MOL格式結(jié)構(gòu)式，再導入至Swiss Target prediction數(shù)據(jù)庫中預測主要活性成分的作用靶點，然后利用Venny 2.1平臺獲得與治療COVID-19存在交集的潛在靶點，最終獲得活性成分與疾病共有靶標。

1.5網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 本文采用軟件Cytoscape 3.7.2版本構(gòu)建復方銀花解毒顆粒治療COVID-19的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，并采用部分插件分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)。

1.6基因的富集分析 本文采用PANTHER數(shù)據(jù)庫對復方銀花解毒顆?；钚猿煞种蓄A測出與治療COVID-19存在交集的靶點進行基因本體(GO)注釋，并對其靶點蛋白的分子功能、生物進程和細胞成分進行注釋；然后利用String數(shù)據(jù)庫發(fā)掘蛋白間的相互作用，形成蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。在此基礎(chǔ)上利用KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)靶標蛋白的富集信息，并繪制出P<0.01的前20條通路高級氣泡圖。

2 體外藥效驗證與實驗方法

本文以人冠狀病毒HCoV-229E和HCoV-OC43分別感染人肝癌Huh7細胞和人肺癌H460細胞為模型，以細胞病變保護效力實驗為參考指標對復方銀花解毒顆粒是否具有抗新型冠狀病毒的作用進行了探討。方法：Huh7和H460細胞按照1.5×104個·孔-1接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)后分別將含有100 TCID50HCoV-229E和HCoV-OC43的病毒液滴入96孔板內(nèi)感染細胞，加入含待測藥物的維持液，待測藥物以3倍稀釋6～8個劑量的樣品進行實驗，待病毒對照組出現(xiàn)明顯細胞病變時觀察記錄結(jié)果，并用Reed-Muench法計算藥物對病毒的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)及選擇指數(shù)(SI)，SI=IC50÷TC50(TC50為藥物半數(shù)毒性質(zhì)量濃度)，其中SI值高于1即為有效，SI值越大，藥物越安全[8]。公式：

其中：A表示累積抑制率<50%的藥物質(zhì)量濃度；B表示累積抑制率>50%的抑制率；C表示累積抑制率<50%的抑制率；D表示lg稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1復方銀花解毒顆粒活性成分篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得復方銀花解毒顆粒處方的化學成分，篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18，進一步剔除無明確smiles號和作用靶點的化合物，篩選到109個活性化合物(青蒿、金銀花、荊芥、薄荷、野菊花、大青葉、連翹、鴨跖草、淡豆豉和前胡中分別含有18、15、9、9、7、8、18、4、2、19個)。山柰酚、木犀草素、槲皮素、豆甾醇、谷甾醇和β-谷甾醇為該藥方中多味中藥的共有成分，刪除重復最終獲得80個活性化合物參與后續(xù)網(wǎng)絡(luò)藥理學分析，見表1。

3.2化合物靶點和疾病靶點的獲取 采用Genecards數(shù)據(jù)庫對治療COVID-19的相關(guān)靶點進行搜索，共得到相關(guān)靶點2 202個，其中“score≥15”的靶點有220個。將活性化合物SDF或MOL結(jié)構(gòu)式導入Swiss Target prediction數(shù)據(jù)庫中獲得無重復的化合物靶點822個。

3.3化合物中與COVID-19疾病相關(guān)靶點預測 將化合物的預測靶點與疾病相關(guān)靶點進行比對查重，得到藥物與疾病相互作用的共有靶點63個，按照相關(guān)性得分值由高到低依次排列，得分越高，說明與疾病關(guān)系越大，見表2。由表2可知，ACE、VEGFA、TNF、NOS3等得分較高的為治療COVID-19的主要靶點。在靶點化合物的比對中發(fā)現(xiàn)，ACE為青蒿活性成分金色酰胺醇酯(MOL007415)的主要靶點，VEGFA為薄荷活性成分柚皮素(MOL004328)的主要靶點，TNF主要為鴨跖草中鴨跖黃酮苷(MOL006836)、前胡中茵芋苷(MOL013083)以及連翹中乳甾醇(MOL003365)的主要靶點，NOS3為前胡中絲立尼亭(MOL013098)、白花前胡甲素(MOL013079)、白花前胡香豆精Ⅱ(MOL013087)以及白花前胡素E(MOL013078)的主要靶點，MPO為槲皮素、山柰酚、脫氧青蒿素(MOL007426)、異鼠李素(MOL000354)、(+)-荷包牡丹堿(MOL000791)、木犀草素、芫花素(MOL005573)、條葉薊素(MOL007401)、漢黃芩素(MOL000173)、香葉木素(MOL002881)、金合歡素(MOL001689)等活性成分的共有靶點，來源于多種藥材，提示青蒿、薄荷、鴨跖草、連翹、前胡在治療COVID-19中具有重要意義。

表2 活性化合物與COVID-19的共有靶點

3.4“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在不同數(shù)據(jù)庫中搜索活性化合物所對應(yīng)的靶點，篩選出重復后得到化合物靶點，構(gòu)建“成分-靶點”可視化圖，見圖1。由圖1可知，其中黃色表示化合物靶基因，紅色節(jié)點表示活性化合物，邊則表示化合物與靶點的相互作用關(guān)系，節(jié)點度(Degree)是指和該節(jié)點相關(guān)聯(lián)的邊的條數(shù)，節(jié)點度越高，說明該化合物或靶點在該網(wǎng)絡(luò)中越重要，在此網(wǎng)絡(luò)圖中共有活性化合物76個，邊657條，平均節(jié)點度值為8.6。在化合物中值最高的是化合物N-阿魏酰酪胺(MOL006834)，來源于鴨跖草，節(jié)點度值高于15的化合物主要來源有鴨跖草、金銀花、青蒿、連翹、野菊花、薄荷等。見表3。

圖1 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

表3 節(jié)點度>15的活性化合物及對應(yīng)藥材分析

3.5共有靶點的GO分析 為了進一步觀察復方銀花解毒顆粒治療COVID-19的分子機制，對共有靶點進行GO分析，采用PANTHER軟件對63個共有蛋白進行GO注釋以評估其參與的生物進程、分子功能和細胞組分，見表4。生物進程圖表明與這些蛋白參與代謝、免疫調(diào)節(jié)、生物黏附、應(yīng)激反應(yīng)以及細胞增殖有關(guān)。分子功能圖顯示蛋白主要的功能是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、催化、分子傳導以及傳導調(diào)控等功能；細胞組分顯示蛋白主要是由細胞膜、蛋白質(zhì)復合物以及膜部件和細胞器等成分組成。利用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。由圖2可知，網(wǎng)絡(luò)圖中的連線為已被證實的蛋白間相互作用，STAT1、MAPK1、EGFR、RAF1、PTPN11、VEGFR、CASP8、AKT1、NOS3、AR、MMP3等蛋白參與的信號網(wǎng)絡(luò)較多，在通路調(diào)控中發(fā)揮重要作用；而ACE、ADA、CCL2、SCN5A、HMGCR等蛋白較為孤立，需要進一步研究。

表4 復方銀花解毒顆粒與COVID-19的共有靶點GO分析

圖2 復方銀花解毒顆粒與COVID-19共有靶點蛋白相互作用圖

3.6信號通路富集分析確認關(guān)鍵靶標和通路 利用 KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫對復方銀花解毒顆粒治療COVID-19的63個共有蛋白進行通路富集分析，選取了P<0.01的前20條通路，分別與腫瘤信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、甲型流感信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路、人T細胞白血病病毒1型感染、C型凝集素受體信號通路、人乳頭瘤病毒感染、人巨細胞病毒感染、丙型肝炎等信號有關(guān)，分析發(fā)現(xiàn)，復方銀花解毒顆粒的富集通路與清肺排毒湯富集通路基本相似[9]，提示復方銀花解毒顆粒具有潛在治療COVID-19的作用。

3.7復方銀花解毒顆粒體外抗冠狀病毒的藥效作用驗證 本研究結(jié)果表明，復方銀花解毒顆粒在無明顯毒性劑量條件下對HCoV-229E和HCoV-OC43感染所致的細胞病變具有良好的保護作用，見表4。由表4可知，復方銀花解毒顆粒對HCoV-229E感染Huh7細胞和對HCoV-OC43感染H460細胞所致細胞病變具有較好的保護作用，其IC50分別為438.16±166.04、165.13±28.37 μg·mL-1，治療指數(shù)SI分別為4.64、17.78。以上結(jié)果提示，復方銀花解毒顆粒在無毒性劑量條件下對人冠狀病毒HCoV-OC43和HCoV-229E感染所致的細胞病變均具有較好的保護作用。

圖3 復方銀花解毒顆粒與COVID-19共有靶點通路富集的氣泡圖

表4 受試藥物對HCoV-229E感染Huh7細胞所致病變的保護作用

4 討論

復方銀花解毒顆粒由治療“時行感冒”的臨床經(jīng)典方“銀翹散”優(yōu)化組方而來，其組方選藥以辛涼清解治法為依據(jù)，具有疏表透邪、輕宣肺氣的作用，且有清熱解毒之功。鑒于COVID-19具有與古代“時行感冒”臨床癥狀及病程轉(zhuǎn)歸類似的特點，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對復方銀花解毒顆粒是否具有治療COVID-19的作用及其潛在的機制進行了預測分析，結(jié)果預測到從復方銀花解毒顆粒中篩選出的80個活性化合物存在 822個作用靶點，而預測到的COVID-19相關(guān)靶點2 202個，其中藥物與COVID-19存在交叉的共有靶點341個，得分>15分的靶點為63個，靶點指認化合物共76個，提示復方銀花解毒顆粒中絕大多數(shù)活性化合物都參與到COVID-19的抑制過程中。

網(wǎng)絡(luò)藥理學分析表明，青蒿在抑制COVID-19靶點上發(fā)揮了重要作用，條葉薊素、茵陳黃酮和薊黃素靶點與COVID-19一致的分別有17、16、16個，青蒿中其他成分青蒿素、青蒿素Ⅰ、青蒿素Ⅱ、脫氧青蒿素、青蒿素Ⅳ、青蒿素Ⅴ、青蒿醇、蒿黃素、中國薊醇、鼠李素、山柰酚、槲皮素、木犀草素和萬壽菊素指認COVID-19靶點也較多。有文獻報道，青蒿素對新型冠狀病毒具有抑制作用[10]，青蒿鞣制具有抗病毒活性[11]，青蒿制劑具有抗豬流感病毒的作用[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，青蒿活性化合物諸多靶點與COVID-19靶點一致，其活性成分異鼠李素經(jīng)分子對接證明與新型冠狀病毒親和力較高[13]，其他與多種藥材(金銀花、青蒿、荊芥、野菊花、連翹)共有的活性成分如槲皮素、山柰酚、木犀草素等也經(jīng)分子對接等證實與新型冠狀病毒受體有較高吻合度[13-15]；提示青蒿在復方銀花解毒顆粒治療COVID-19中可能發(fā)揮重要作用。本次分析發(fā)現(xiàn)，鴨跖草、薄荷等藥材活性成分指認COVID-19靶點也較多，有文獻證明，鴨跖草水提物能夠抗流感病毒[16]。袁琦等[17]研究發(fā)現(xiàn)，鴨跖草不同提取物能夠抗呼吸道合胞病毒(RSV) 和單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)，鴨跖草抗病毒作用可能與其能夠抑制α-葡糖苷酶活性有關(guān)。徐佳馨等[18]報道薄荷能夠抗單純皰疹病毒、抗呼吸道合胞病毒，薄荷水提物對牛痘病毒、孤兒病毒、Semliki森林病毒和流行性腮腺病毒均有抑制作用，薄荷中的芫花素能夠抑制非洲豬瘟病毒[19]，與其他藥材共有的活性成分槲皮素能夠抗皰疹病毒和流感病毒[20]。以上分析表明，金銀花、青蒿、荊芥、野菊花、連翹、鴨跖草、薄荷等在復方銀花解毒顆粒治療COVID-19中具有重要作用，體現(xiàn)了中藥多組分、多靶點的臨床優(yōu)勢。

GO分析發(fā)現(xiàn)STAT1、MAPK1、EGFR、RAF1、PTPN11、VEGFR、CASP8、AKT1、NOS3、AR、MMP3等蛋白參與的信號網(wǎng)絡(luò)較多，參與各項藥理活動較為活躍，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)靶點參與了卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、甲型流感信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路、人T細胞白血病病毒1型感染、C型凝集素受體信號通路、人乳頭瘤病毒感染、人巨細胞病毒感染、丙型肝炎等信號通路，顯示了復方銀花具有抑制病毒、抗炎、免疫的作用。

本研究以人冠狀病毒HCoV-OC43和HCoV-229E體外感染細胞為模型，首次對復方銀花解毒顆?？构跔畈《镜乃幮ё饔眠M行了探討。結(jié)果表明，復方銀花解毒顆粒在無毒性劑量條件下對人冠狀病毒HCoV-OC43和HCoV-229E感染所致的細胞病變均具有較好的抑制作用。

綜上所述，復方銀花解毒顆粒治療COVID-19能通過其有效活性成分青蒿素、異鼠李素、芫花素、槲皮素、木犀草素、山柰酚等作用于STAT1、MAPK1、EGFR、RAF1、PTPN11、VEGFR、CASP8、AKT1、NOS3、ACE、CCL2等靶點,調(diào)控甲型流感信號通路、IL-17信號通路、人T細胞白血病病毒1型感染、人乳頭瘤病毒感染、人巨細胞病毒感染、丙型肝炎等信號通路，抑制COVID-19，改善肺炎患者的臨床癥狀。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學角度首次闡述了復方銀花解毒顆粒的多成分、多靶標調(diào)控機體信號通路發(fā)揮抗多種病毒的潛在作用機制，為探討該藥臨床用于治療病毒性肺炎的潛在機制與作用靶標提供了新思路。