HPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定羽裂蟹甲草花中3種香豆素的含量

高 昕，楊怡璇，張曉娜，劉 霞*

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061； 2.甘肅百草中藥材種植有限公司，蘭州 730102)

菊科(Compositae)蟹甲草屬(CacaliaLinn.)植物約有80種，分布于亞洲東北部和美洲，我國(guó)有60余種，主產(chǎn)地為西北地區(qū)和西南地區(qū)[1]。我國(guó)民間共有26種該屬植物被用作傳統(tǒng)中藥[2]，其具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、消炎止咳及消腫止痛等功效，主治風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、肺結(jié)核、支氣管炎、跌打損傷、血崩、咳血、痢疾和水腫等癥[3]。由于蟹甲草屬植物具有很好的藥用價(jià)值，因此對(duì)該屬植物中活性成分的研究及開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。作者對(duì)采自甘肅尖山的羽裂蟹甲草[Cacaliatangutica(Franch.) Hand.-Mazz.]的花進(jìn)行了化學(xué)成分研究，從中分離得到了7-羥基香豆素(HC)、7-羥基-8-甲氧基香豆素(HMC)和7β-D-葡萄糖-8-羥基香豆素(GC)共3種香豆素類(lèi)化合物。文獻(xiàn)報(bào)道[4-7]，香豆素類(lèi)化合物具有抗菌、抗病毒、抗凝血、抗高血壓、抗癌等多種藥理作用。為了更全面了解該植物的特性，有必要對(duì)其中的3種香豆素類(lèi)活性成分進(jìn)行分離測(cè)定，使之成為有用的質(zhì)量控制指標(biāo)。

天然藥物中的香豆素類(lèi)化合物的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、液質(zhì)聯(lián)用法及高效液相色譜法(HPLC)。迄今為止，還沒(méi)有關(guān)于羽裂蟹甲草花中香豆素類(lèi)化合物的HPLC分析的報(bào)道。因此，本文首次建立了羽裂蟹甲草花中香豆素類(lèi)化合物的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)(HPLC-PDA)的分離分析及含量測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、可靠，可用于羽裂蟹甲草中香豆素類(lèi)化合物的含量測(cè)定，并為該植物的開(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters高效液相色譜儀(包括Waters Delta 600四元梯度泵、2996二極管陣列檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器、Millennium32數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng))，美國(guó)Waters公司；KQ-250B型超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；CH-8606型微量分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2試藥 7-羥基香豆素(HC)、7-羥基-8-甲氧基香豆素(HMC)和7β-D-葡萄糖-8-羥基香豆素(GC)對(duì)照品，均由作者從羽裂蟹甲草花中自行分離獲得(質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>98.0%)，結(jié)構(gòu)經(jīng)多種波譜技術(shù)確定，1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的相應(yīng)化合物數(shù)據(jù)[8-12]一致。羽裂蟹甲草花于2001年8月采自甘肅省尖山鄉(xiāng)，經(jīng)西安交通大學(xué)牛曉峰教授鑒定為菊科(Compositae)蟹甲草屬(CacaliaLinn.)羽裂蟹甲草[Cacaliatangutica(Franch.) Hand.-Mazz.]的花。甲醇、四氫呋喃(色譜純)，美國(guó)Fisher公司；醋酸(分析純)，西安化學(xué)試劑廠；水為自制二次重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-四氫呋喃-10 mL·L-1醋酸(27∶7∶66)；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；在線脫氣：氦氣。理論塔板數(shù)以HMC峰計(jì)算不低于10 000。

2.2溶液的制備

2.2.1單一對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取HC、HMC和GC對(duì)照品各2.0 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2混合對(duì)照品溶液 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的3種單一對(duì)照品儲(chǔ)備液2、1、0.5 mL，置于10 mL量瓶中，混勻，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得3種成分質(zhì)量濃度分別為40、20、10 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液 精密稱取陰干的羽裂蟹甲草花2.0 g，粉碎過(guò)3號(hào)篩，置于50 mL具塞錐形瓶中，用甲醇50 mL超聲(功率250 W，頻率40 kHz)提取2次，每次30 min，合并提取液，濾過(guò)后減壓回收甲醇，所得浸膏用甲醇溶解并移至10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，備用。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系及檢測(cè)限的確定 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的3種單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇逐步稀釋成HC(120、80、40、20、10、5、2、1 μg·mL-1)，HMC(120、80、40、20、10、5、2、1 μg·mL-1)，GC(120、80、40、20、10、5、2 μg·mL-1)的單一對(duì)照品溶液，各溶液按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣3次，取其峰面積的平均值。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、色譜峰面積的平均值為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到HC、HMC和GC標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程分別為：y1=5.340×107x1+9.064×104(r1=0.999 8)，y2=5.580×107x2+2.580×104(r2=0.999 8)，y3=1.172×107x3+3.914×103(r3=0.999 9)。結(jié)果表明，3種化合物質(zhì)量濃度分別在1～120、1～120、2～120 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。3種化合物的最低檢測(cè)限(S/N=3)分別為1.3、1.0、2.8 ng，定量限(S/N=10)分別為4.2、3.4、9.0 ng。

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液10 μL，于同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算日內(nèi)精密度，求得HC、HMC和GC峰面積的RSD值 (n=5) 分別為0.47%、0.92%、1.61%；連續(xù)5 d內(nèi)(每日1次)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算日間精密度，結(jié)果HC、HMC和GC峰面積的RSD值(n=5) 分別為1.83%、2.36%、2.51%，表明儀器精密度良好。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取羽裂蟹甲草花樣品5份，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，3種化合物的平均含量分別為0.65、0.32、0.13 mg·g-1，RSD 值(n=5)分別為3.12%、2.70%、2.16%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果3種化合物峰面積的RSD值分別為0.74%、1.09%、1.33%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5回收率實(shí)驗(yàn) 稱取6份含量已知的羽裂蟹甲草花樣品1 g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中。精密稱取3種化合物對(duì)照品6.2、2.9、1.2 mg，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液。精密吸取該混合對(duì)照品溶液5 mL，加入上述具塞錐形瓶中，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.4樣品測(cè)定 精密吸取2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液及混合對(duì)照品溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定5份，按照外標(biāo)法計(jì)算含量。測(cè)得羽裂蟹甲草花中HC、GC、HMC的含量分別為0.65、0.32、0.13 mg·g-1，RSD值分別為3.1%、2.7%、2.1% (n=5)。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]，對(duì)于香豆素類(lèi)化合物所采用的檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm或采用其他波長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器分別對(duì)進(jìn)樣后的HC、HMC和GC對(duì)照品溶液進(jìn)行了全波長(zhǎng)(200～400 nm)掃描，發(fā)現(xiàn)這3種化合物在325 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選定325 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2提取條件的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)[16-18]，甲醇對(duì)于3種化合物具有較好的溶解性和提取效率，因此在本實(shí)驗(yàn)中選用甲醇作為提取溶劑。稱取樣品2.0 g，共3份，分別采用超聲提取法、加熱回流法、索氏提取法提取2 h，測(cè)定HC、HMC和GC的含量，結(jié)果超聲提取法、加熱回流法含量較高，而超聲處理簡(jiǎn)單，故確定提取方法為超聲提取法。同時(shí)，進(jìn)行了提取次數(shù)的考察，取樣品2.0 g，共4份，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，用甲醇50 mL分別超聲提取1、2、3、4次(每次30 min)，測(cè)定HC、HMC和GC的含量，結(jié)果超聲提取2次后，含量不再增加，故超聲提取次數(shù)確定為2次。另外，對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)的提取溶劑也進(jìn)行了考察，采用體積分?jǐn)?shù)分別為80%、50%的甲醇和甲醇分別超聲提取2次，每次30 min，結(jié)果表明，采用甲醇提取時(shí)樣品中3種化合物的含量最高，故采用甲醇作為提取溶劑。

3.3流動(dòng)相的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)[15，19-20]，對(duì)于含有酚羥基的香豆素類(lèi)化合物，流動(dòng)相中加入少量酸能使峰形變得尖銳，本實(shí)驗(yàn)嘗試在流動(dòng)相中加入醋酸，分別以甲醇-10 mL·L-1醋酸和乙腈-10 mL·L-1醋酸作為流動(dòng)相，采用等度洗脫或梯度洗脫，結(jié)果HC和HMC都難以分離或需要很長(zhǎng)時(shí)間才能分離；在嘗試用部分四氫呋喃代替甲醇作為改性劑后，取得了較好的分離效果。最終實(shí)驗(yàn)表明，采用甲醇-四氫呋喃-10 mL·L-1醋酸(27∶7∶66)作為流動(dòng)相等度洗脫，流速為0.8 mL·min-1，12 min內(nèi)就能將3種化合物很好地分離。

4 結(jié)論

香豆素類(lèi)化合物是羽裂蟹甲草的有效化學(xué)物質(zhì)，是含苯駢α-吡喃酮結(jié)構(gòu)的芳香含氧雜環(huán)化合物，是重要的植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗病毒、抗凝血等生物活性，具有藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定羽裂蟹甲草花中3種香豆素類(lèi)化合物的HPLC-PDA法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、選擇性好，可為羽裂蟹甲草植物的開(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量控制提供參考。