響應(yīng)面法優(yōu)化滇黃精多酚的提取工藝及抗氧化活性

楊勇幫，胡棟寶，普曉燕，楊 猛

(1.玉溪市食品藥品檢驗(yàn)所，玉溪 653100；2.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，玉溪 653100)

滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl)屬百合科植物，有節(jié)節(jié)高、德保黃精和仙人飯等多個(gè)名稱，主產(chǎn)于中國(guó)云、貴、川等地[1]。滇黃精藥用部位為干燥根莖，性平、味甘，兼具抗病毒、止血、抗疲勞、降血糖、抗氧化、滋陰補(bǔ)氣及健脾潤(rùn)肺等功能，可預(yù)防心血管疾病、脾胃虛弱、體虛無(wú)力、口干舌燥、肺虛燥咳、精血無(wú)余等癥[2]。滇黃精的主要化學(xué)成分有生物堿、木質(zhì)素、蒽醌、甾體皂苷、三萜、黃酮、多酚、多糖及揮發(fā)油等活性物質(zhì)[3-4]。目前，關(guān)于滇黃精中多糖和黃酮類(lèi)物質(zhì)的研究較多，但對(duì)其多酚類(lèi)物質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。多酚類(lèi)物質(zhì)抗氧化活性較強(qiáng)，能很好地清除自由基，延緩衰老[5]，為了更好地開(kāi)發(fā)利用滇黃精的食用、藥用價(jià)值，本研究應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面法[6-9]，以滇黃精多酚提取量為參考標(biāo)準(zhǔn)，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，研究滇黃精多酚的抗氧化活性，為藥食同源資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1儀器 SHZ-D(Ⅲ)型水循環(huán)真空泵(鞏義市子華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)；H2-16K型臺(tái)式高速微量離心機(jī)(河南可成儀器設(shè)備責(zé)任有限公司)；CAV114C型電子分析天平(奧豪斯電子儀器有限公司)；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器責(zé)任有限公司)；EYELA型水浴鍋(上海愛(ài)朗儀器有限分公司)；SY3200-T型超聲波清洗設(shè)備(上海聲源超聲波儀器技術(shù)設(shè)備管理有限公司)。

1.2試藥 滇黃精藥材，采自云南省玉溪市新平縣哀牢山，經(jīng)玉溪市食品藥品檢驗(yàn)所牟娟副主任中藥師鑒定為百合科植物滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl)的根莖。沒(méi)食子酸(分析純)，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；甲醇、丙酮(分析純)，四川西隴化工技術(shù)有限公司；抗壞血酸(分析純),天津市雙船化學(xué)試劑廠；福林酚、碳酸鈉(分析純),均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(分析純),均購(gòu)自艾科達(dá)成都化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉(分析純),天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技發(fā)展有限公司；三氯乙酸(分析純),天津市大茂化學(xué)試劑廠；福林酚試劑(分析純)，南京都萊生物技術(shù)有限公司；鐵氰化鉀(分析純)，四川西隴化工技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1滇黃精多酚的提取 精密稱定0.5 g滇黃精粉末，置于錐形瓶中，精密加入10 mL不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，混勻后置于功率為220 W的超聲儀中超聲提取1 h，抽濾，收集濾液，濾渣中加入一定量的乙醇再重復(fù)抽濾2次，合并濾液，置于25 mL比色管中，加不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇稀釋至刻度，即得滇黃精多酚提取液。在10 mL試管中加入滇黃精多酚提取液1 mL及福林酚試劑0.5 mL，振蕩并搖勻，靜止放置反應(yīng)5～7 min，再加入150 g·L-1的碳酸鈉溶液1.5 mL，混勻，冷卻至室溫，避光靜置1 h，用超純水作空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在400～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸光度值，測(cè)得滇黃精多酚的最大吸收波長(zhǎng)為740 nm。

2.2繪制沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱定沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，置于50 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇40 mL溶解并稀釋至刻度，得0.2 mg·mL-1的沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于25 mL比色管中，按順序分別加入福林酚試劑0.5 mL，振蕩搖勻并靜置反應(yīng)5～7 min，加入150 g·L-1的碳酸鈉溶液1.5 mL并稀釋至10 mL刻度，冷卻至室溫，避光靜置反應(yīng)1 h，在740 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。以沒(méi)食子酸溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、吸光度值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=78.314x+0.043 3(R2=0.996 7)。

2.3滇黃精多酚的測(cè)定 取1.2.1項(xiàng)下制備的滇黃精多酚提取液1 mL和福林酚試劑0.5 mL，振蕩并搖勻，靜止放置反應(yīng)5～7 min，加入150 g·L-1的碳酸鈉溶液1.5 mL，混勻，冷卻至室溫，避光靜置1 h，用超純水作空白對(duì)照，吸收波長(zhǎng)為740 nm。測(cè)定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算滇黃精多酚的質(zhì)量濃度。各實(shí)驗(yàn)組平行取樣3份進(jìn)行測(cè)定，取其平均吸光度值代入沒(méi)食子酸線性回歸方程計(jì)算滇黃精多酚質(zhì)量濃度，根據(jù)公式計(jì)算滇黃精多酚的提取量：G=(T×V2×V1) ÷(m×V)，式中：G為滇黃精多酚的提取量(mg·g-1)；T為滇黃精多酚質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；V1為首次稀釋后體積(mL)；V2為二次稀釋后體積(mL)，定容至10 mL；V為移取的樣品體積(mL)；m為滇黃精取樣粉末質(zhì)量(g)。

2.4單因素實(shí)驗(yàn)提取滇黃精多酚 考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、液料比(30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1)、超聲時(shí)間(30、40、50、60、70、80 min)以及不同提取溶劑(蒸餾水、體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)為40%的丙酮)4個(gè)因素對(duì)滇黃精多酚提取量的影響，綜合分析確定其最佳提取條件。各因素分別設(shè)置3個(gè)因素，每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

2.5響應(yīng)曲面法優(yōu)化總多酚實(shí)驗(yàn) 參照Box-Behnken設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)曲面的優(yōu)化影響因素分別為乙醇體積分?jǐn)?shù) (A)、超聲時(shí)間 (B)和液料比(C)，以滇黃精多酚提取量作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素與水平

2.6抗氧化實(shí)驗(yàn) 按照響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件(乙醇體積分?jǐn)?shù)為38.7%、超聲時(shí)間為58 min、液料比為55∶1)，按照1.2.1項(xiàng)下方法提取滇黃精多酚提取液，調(diào)整波長(zhǎng)至740 nm處，測(cè)定吸光度值，通過(guò)線性回歸方程計(jì)算得滇黃精多酚的質(zhì)量濃度為0.008 mg·mL-1，設(shè)置不同的質(zhì)量濃度梯度，分別用DPPH、ABTS、三價(jià)鐵離子作為抗氧化試劑，對(duì)滇黃精多酚提取液的還原能力進(jìn)行測(cè)定，以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。

2.6.1DPPH自由基清除活性的測(cè)定 準(zhǔn)確稱量4.0 mg的DPPH，置于100 mL量瓶中，加乙醇得濃度為0.1 mmol·L-1的DDPH溶液，移取1 mL不同質(zhì)量濃度梯度(0.002、0.004、0.006、0.008 mg·mL-1)的滇黃精多酚提取液，置于比色管中，加入DPPH溶液2 mL，室溫靜置30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值(Ax)，然后用1 mL吸量管準(zhǔn)確移取1 mL不同質(zhì)量濃度的滇黃精多酚提取液置于試管中，用2 mL乙醇替代自變量DPPH，靜置30 min后測(cè)定其吸光度值(Ay)；準(zhǔn)確移取2 mL乙醇置于干燥的試管中，按順序加入2 mL DPPH溶液，放置30 min后，測(cè)定吸光度值(A0)，用抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算 DPPH清除率，DPPH清除率=1-(Ax-Ay)÷A0。

2.6.2ABTS自由基清除能力的測(cè)定 準(zhǔn)確稱量0.038 4 g ABTS固體和0.013 4 g過(guò)硫酸鉀固體，分別置于10 mL量瓶中，加超純水定容至刻度，取上述溶液和過(guò)硫酸鉀按照1∶1的比例混合，搖勻，冷卻至室溫，避光放置16 h，制成ABTS工作液，備用。取5 mL ABTS工作液，加無(wú)水乙醇，調(diào)整波長(zhǎng)至734 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)；取1 mL不同質(zhì)量濃度(0.002、0.004、0.006、0.008 mg·mL-1)的滇黃精多酚提取液置于比色管中，分別加入ABTS溶液4 mL，避光靜置10 min，調(diào)整波長(zhǎng)至517 nm處，測(cè)定吸光度值(Ax),移取1 mL不同質(zhì)量濃度的提取液置于比色管中，加入無(wú)水乙醇4 mL代替自變量ABTS，室溫避光靜置10 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(Ay)，移取無(wú)水乙醇4 mL置于比色管中，依次加入ABTS溶液4 mL，放置10 min測(cè)其吸光度值 (A0)，用抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，ABTS清除率=1-(Ax-Ay)÷A0。

2.6.3三價(jià)鐵還原能力的測(cè)定 取1 mL不同質(zhì)量濃度的滇黃精多酚提取液，加入2.5 mL PBS(0.2 mol·L-1，pH值為6.6)和10 g·L-1鐵氰化鉀溶液，混勻，于50 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 min，再加入2.5 mL超純水和0.5 mL三氯乙酸(體積分?jǐn)?shù)為10%)終止反應(yīng)，以5 000 r·min-1離心30 min，取上清液靜置10 min，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，用抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。

3 結(jié)果與分析

3.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)滇黃精多酚提取量的影響 滇黃精多酚提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，原因可能與乙醇的極性有關(guān)，體積分?jǐn)?shù)不相同，極性也不相同，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，其極性和滇黃精多酚極性最接近，溶解性最好，使其大量溢出[9]；體積分?jǐn)?shù)較低的乙醇可進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部并溶解液泡中的水溶性酚類(lèi)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)則會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，阻礙滇黃精多酚的提取[10]。另外，脂溶性雜質(zhì)成分與乙醇-水分子結(jié)合能力與乙醇體積分?jǐn)?shù)成正比，形成了競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，從而導(dǎo)致滇黃精多酚提取量的降低，所以乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低或過(guò)高都不利于滇黃精多酚的斷裂和擴(kuò)散[11]。

3.1.2液料比對(duì)滇黃精多酚提取量的影響 滇黃精多酚提取量與液料比的變化規(guī)律：液料比為60∶1時(shí)，滇黃精多酚的提取效果最佳，隨后下降，液料比過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使其他物質(zhì)(如多糖)溶出而影響滇黃精多酚析出[9-10]。其次，滇黃精多酚的量是一定的，到達(dá)一定程度就無(wú)法析出，所以即使增多溶劑量也無(wú)法增多滇黃精多酚的提取量,因此60∶1是提取滇黃精多酚的最佳液料比。

3.1.3超聲時(shí)間對(duì)滇黃精多酚提取量的影響 超聲時(shí)間為60 min時(shí)提取效果最佳，原因是超聲時(shí)間過(guò)短，滇黃精多酚類(lèi)物質(zhì)未完全與組織分離；而超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生機(jī)械力和熱能降解，從而使滇黃精多酚類(lèi)物質(zhì)遭到破壞，降低提取量[10-13]。因此超聲時(shí)間為60 min時(shí)，滇黃精多酚的提取量最大，為1.125 mg·g-1。

3.1.4不同溶劑對(duì)滇黃精多酚提取量的影響 考察不同溶劑對(duì)滇黃精多酚提取量的影響，結(jié)果為：蒸餾水<體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇<體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇<體積分?jǐn)?shù)為40%的丙酮，這可能是由于滇黃精多酚在蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇中溶解不充分，可以使滇黃精多酚的氫鍵和疏水鍵與組織內(nèi)物質(zhì)斷裂而充分溶出，因此體積分?jǐn)?shù)為40%的丙酮提取量更高[13]。

3.2Box-Behnken優(yōu)化提取工藝

3.2.1使用Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 見(jiàn)表2和表3。由表2可知，滇黃精多酚提取量的回歸方程為Y=0.86-0.028A+0.051B+0.083C+0.019AB-0.026AC+0.053BC-0.03A2+0.013B2-0.026C2,相關(guān)系數(shù)R2=0.991 5，對(duì)線性回歸方程分析可知，擬合狀況較好，結(jié)果可靠。由表3可知，模型的F=90.50，P<0.000 1，該模型顯著性差異小且數(shù)據(jù)擬合度高。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腞2=0.991 5表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)性一致性良好，表明該回歸模型擬合性好、回歸方程代表性良好，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)際情況。Radj2=0.980 5表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果為0.980 5時(shí)受實(shí)驗(yàn)因素影響，模型能解釋98.05%響應(yīng)值變化。變異系數(shù)(CV)=0.86%表明實(shí)驗(yàn)隨機(jī)誤差小，失擬值P=0.014<0.005表明該方程具有較好的擬合性，方法可取，滇黃精多酚提取量的測(cè)定可用該方法進(jìn)行預(yù)測(cè)。分析可知，滇黃精多酚提取量受3個(gè)因素影響的順序依次為：液料比(C)>超聲時(shí)間(B)>體積分?jǐn)?shù)(A)。

表2 滇黃精多酚提取工藝響應(yīng)面設(shè)計(jì)及其結(jié)果

表3 線性模型的方差分析

3.2.2響應(yīng)面分析 在響應(yīng)面圖中，曲面形狀反映出響應(yīng)曲面點(diǎn)的交互作用對(duì)滇黃精多酚提取量的影響，曲面坡度傾斜度越大，影響越大，曲面坡度傾斜度越小，影響越小[9-12]。見(jiàn)圖1。由圖1可知，液料比對(duì)滇黃精多酚提取量的影響大于超聲時(shí)間，超聲時(shí)間對(duì)滇黃精多酚提取量的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)，曲面坡度傾斜度最大，對(duì)多酚提取量的影響呈高度顯著。采用Box-Behnken優(yōu)化提取工藝，得最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為38.7%，液料比為55∶1，超聲時(shí)間為58 min。

圖1 響應(yīng)面分析圖

3.3抗氧化活性 見(jiàn)表4。由表4可知，不同質(zhì)量濃度滇黃精多酚提取液和維生素C溶液對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力、三價(jià)鐵的還原能力有如下規(guī)律：當(dāng)兩者質(zhì)量濃度為0.002 mg·mL-1時(shí)，維生素C溶液對(duì)DPPH自由基的清除能力以及三價(jià)鐵的還原能力強(qiáng)于滇黃精多酚提取液；當(dāng)兩者質(zhì)量濃度為0.004 mg·mL-1時(shí)，對(duì)于DPPH自由基的清除能力以及三價(jià)鐵的還原能力，滇黃精多酚提取液和維生素C溶液兩者能力接近；而當(dāng)兩者質(zhì)量濃度大于0.006 mg·mL-1時(shí)，滇黃精多酚提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力以及三價(jià)鐵的還原能力均強(qiáng)于維生素C溶液，最佳清除率達(dá)到89%。滇黃精多酚提取液和維生素C溶液對(duì)ABTS自由基的清除能力也隨兩者的質(zhì)量濃度變化呈正比，對(duì)ABTS自由基的清除能力表現(xiàn)為：滇黃精多酚提取液在不同質(zhì)量濃度下清除能力均強(qiáng)于維生素C溶液，特別是在質(zhì)量濃度大于0.006 mg·mL-1時(shí)，兩者對(duì)自由基清除能力相差較大，滇黃精多酚提取液對(duì)自由基的最佳清除率能達(dá)到88%。

表4 滇黃精多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除率及三價(jià)鐵的還原能力

4 結(jié)論

采用超聲波輔助技術(shù)提取滇黃精多酚，探究4個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)其提取量的影響，確定最佳提取條件；再采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝得到滇黃精多酚的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為38.7%，液料比為55∶1，超聲時(shí)間為58 min?？寡趸钚越Y(jié)果表明，除在0.002和0.004 mg·mL-1質(zhì)量濃度時(shí)，滇黃精多酚提取液的DPPH自由基清除率略小于維生素C溶液或與維生素C溶液接近；其余的相同質(zhì)量濃度水平，滇黃精多酚提取液的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率以及三價(jià)鐵還原能力均高于維生素C溶液，可為天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)提供參考。