生物炭對土壤細(xì)菌種群多樣性的影響

侯寧，宋秋穎，王啟全，張楠楠

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

Cr是一種有毒重金屬物質(zhì)，近年來現(xiàn)代工業(yè)高速發(fā)展，環(huán)境中Cr含量逐漸升高，嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境，危害人體健康。生物炭（Biochar，BC）是在限氧條件下通過生物質(zhì)熱解獲得的材料，因其具有良好介孔結(jié)構(gòu)及豐富的表面官能團(tuán)，已被應(yīng)用于各類型環(huán)境污染物吸附研究[1]。目前，Yang等發(fā)現(xiàn)生物炭在降解污染物方面存在潛在應(yīng)用[2]，被大量用作光催化反應(yīng)催化劑或催化劑載體應(yīng)用于污染物降解以及環(huán)境修復(fù)中[3]。萬文亞研究表明，加入生物炭可抑制光生空穴-電子對復(fù)合，且拓寬光吸收范圍，提高光催化性能，從而提高污染物降解效率[4]。

值得注意的是，Purakayastha等研究表明生物炭在處理重金屬方面效果突出[5]，而生物炭在處理重金屬過程中對環(huán)境尤其是環(huán)境微生物造成的影響目前鮮為人知，這一問題影響未來生物炭推廣和使用。

本研究在生物炭對重金屬處理方面具有突出效果基礎(chǔ)上，探究不同來源生物炭施加對環(huán)境微生物的影響：①大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭表征分析；②大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭對Cr（Ⅵ）污染土壤中黑麥草生長影響分析；③大豆秸稈生物炭與脫水污泥生物炭對土壤細(xì)菌多樣性影響。研究旨在為秸稈合理利用策略提供理論依據(jù)，為生物炭光催化降解污染物修復(fù)環(huán)境污染提供科學(xué)依據(jù)，對生物炭應(yīng)用推廣具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭材料制備

大豆秸稈取自黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地。脫水污泥取自哈爾濱市文昌污水處理廠。大豆秸稈及脫水污泥經(jīng)清洗后烘干，粉碎，在80℃烘箱內(nèi)烘干過夜。使用管式爐500℃溫度下制備大豆秸稈生物炭（D500）及脫水污泥生物炭（S500）。炭化后樣品經(jīng)研磨過篩（100目）后備用。

1.1.2 土壤來源

土壤樣品來自于黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽試驗(yàn)示范基地常年耕作土壤。供試土壤pH、有機(jī)質(zhì)和陽離子交換量（CEC）分別為7.12、10.22和16.14 cmol·kg-1，土壤中總N、總P、總K含量分別為1.1、0.96、20.8 g·kg-1。

1.2 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭材料表征

使用傅里葉紅外變換光譜，可對大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭含有基團(tuán)定性分析。

利用掃描電鏡分析分析大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭表面構(gòu)型。

本文使用XRD分析大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭，XRD主要參數(shù)為：40 kV，40 mA，2θ角掃描范圍10°~60°，掃描速度2°·min-1。

1.3 盆栽試驗(yàn)

使用黑麥草作為本試驗(yàn)指示性植物。利用盆栽試驗(yàn)開展大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭對Cr（Ⅵ）污染土壤修復(fù)研究。

試驗(yàn)具體方法如下：剔除土壤中植物根莖，粉碎土壤，在通風(fēng)處風(fēng)干后過2 mm篩，每盆裝入2 kg試驗(yàn)土待用。將0.1 mg·mL-1Cr（Ⅵ）溶液1 000 mL拌入土壤中，分為4個試驗(yàn)組：試驗(yàn)組1（同時加入大豆秸稈生物炭D500 100 g）、試驗(yàn)組2（同時加入脫水污泥生物炭S500 100 g）、試驗(yàn)組3（Cr（Ⅵ）污染土壤），試驗(yàn)組4（空白對照組CK），充分混勻，保證供試土壤完全浸濕。靜置24 h穩(wěn)定土壤環(huán)境。

試驗(yàn)期間，土壤含水量始終保持在60%，測定玻璃溫室內(nèi)日間溫度為29℃，夜間溫度為22℃。每經(jīng)過2 d相互交換盆栽在溫室中位置，保證盆栽培養(yǎng)條件相同。在玻璃溫室中開展為期30 d盆栽試驗(yàn)。

1.3.1 植物生長、生理指標(biāo)測定

使用直接收獲法，盆栽試驗(yàn)第30天時，取出植物用水清理后去除表面水分，使用直尺測量黑麥草株高和根長，將植物放入烘箱烘干后使用電子天平稱量確定植物生物量。

1.3.2 土壤中細(xì)菌多樣性檢測

盆栽30 d后收集各試驗(yàn)組土壤，并將試驗(yàn)組1、2、3和4土壤樣本送至上海生工生物工程有限公司作高通量16S rRNA測序，檢查土壤樣本中細(xì)菌群落相對豐度和樣本多樣性。

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次。圖片和表格中數(shù)值表示平均值。使用Origin 2020分析平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭表征

2.1.1 傅里葉紅外光譜分析

傅立葉紅外光譜結(jié)果如圖1所示，圖1a為500℃溫度下制備大豆秸稈生物炭（D500）紅外光譜圖，分析發(fā)現(xiàn)生物炭上具有-OH（3 000 cm-1）、芳香基團(tuán)（1 400 cm-1）、羧基（-COOH1 600 cm-1）等含氧官能團(tuán)。其中芳香苯環(huán)（C=C）所代表芳香族結(jié)構(gòu)可提高生物炭電子傳遞能力，使生物炭作為氧化還原介質(zhì)，促進(jìn)環(huán)境中非定域化氧化還原反應(yīng)發(fā)生[6]。與此同時，大豆秸稈生物炭因羧基基團(tuán)（-COOH）使大豆秸稈生物炭具備一定光敏性，羧基基團(tuán)（-COOH）與其他含氧官能團(tuán)（即-OH，OC-O和C-O）共同在生物炭光催化產(chǎn)生自由基氧化物質(zhì)（ROS）過程中發(fā)揮重要作用[7]。圖1c為脫水污泥生物炭（S500）紅外光譜圖，可發(fā)現(xiàn)脫水污泥生物炭官能團(tuán)與大豆秸稈生物炭官能團(tuán)十分相似。

將脫水污泥生物炭（S500）主要官能團(tuán)含量（見圖1b）與大豆秸稈生物炭（D500）中主要官能團(tuán)含量（見圖1d）作對比，發(fā)現(xiàn)S500中官能團(tuán)主要為1 400 cm-1處羧基（-COOH）基團(tuán)以及500 cm-1附近=C-H基團(tuán)，大豆秸稈生物炭（D500）中-OH基團(tuán)（3 000 cm-1）與C-H基團(tuán)（3 500 cm-1）相較于脫水污泥生物炭（S500）有所增加。

圖1 生物炭FTIR光譜Fig.1 FTIR spectrum of biochar

2.1.2 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭掃描電鏡分析

圖2是大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭掃描電鏡表征結(jié)果。由圖2a可見，脫水污泥生物炭（S500）多級孔隙結(jié)構(gòu)明顯，孔形狀規(guī)則，表面積大，這種特點(diǎn)賦予生物炭良好吸附性能。通過圖2b可發(fā)現(xiàn)，大豆秸稈生物炭（D500）縱面結(jié)構(gòu)存在孔隙，且孔隙均勻，呈橢圓形，孔徑內(nèi)壁光滑，孔內(nèi)仍有組織斷續(xù)連接。綜上，生物炭孔隙結(jié)構(gòu)豐富，可作為一種富孔碳材料，為去除污染物提供充足吸附位點(diǎn)。

圖2 生物炭掃描電鏡結(jié)果Fig.2 Scanning electron micrograph of biochar

2.1.2 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭XRD分析

圖3為脫水污泥生物炭（S500）和大豆秸稈生物炭（D500）X衍射光譜圖，熱解碳化后兩種生物炭XRD曲線中均發(fā)現(xiàn)兩個明顯的包峰，為非晶XRD線形。XRD曲線中存在微弱石墨相碳衍射峰，代表生物質(zhì)原料在熱解過程中發(fā)生石墨化，且生物炭中還存在大量非石墨化雜碳所致。石墨烯以及氮化碳（C3N4）共軛聚合物等石墨碳化物均具有優(yōu)良光催化性能，說明石墨化結(jié)構(gòu)有利于增強(qiáng)生物炭光催化活性。生物炭中形成的石墨相碳結(jié)構(gòu)，通過建立π共軛能帶的sp2雜化碳結(jié)構(gòu)，降低帶隙能量，提高導(dǎo)電性，促進(jìn)光催化過程中載流子擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移，提高光催化活性。

圖3 生物炭XRD光譜Fig.3 XRD spectrum of biochar

2.2 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭對Cr（Ⅵ）污染土壤黑麥草生長的影響

經(jīng)30 d盆栽試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。黑麥草在CK、Cr（Ⅵ）污染以及脫水污泥生物炭（S500）和大豆秸稈生物炭（D500）修正后，30 d不同組黑麥草生長趨勢大體相似，但不同組間株高、根長和生物量卻差異顯著（P<0.05），其中，大豆秸稈生物炭（D500）修復(fù)效果最佳，經(jīng)兩種生物炭修復(fù)過土壤中生長的黑麥草長勢均優(yōu)于受Cr（Ⅵ）污染土壤中生長的黑麥草。值得注意的是，經(jīng)大豆秸稈生物炭（D500）修復(fù)過土壤中生長黑麥草長勢較未污染土壤中生長黑麥草旺盛。綜上，生物炭具有良好Cr（Ⅵ）修復(fù)效果和土壤改良效果，在污染修復(fù)同時促進(jìn)植物生長。

圖4 Cr(Ⅵ)脅迫對黑麥草生長指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of Cr(Ⅵ)stress on growth index of ryegrass

2.3 土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及種群多樣性分析

從豐度稀釋曲線（圖5a）中可看出，當(dāng)序列數(shù)量大于10 000時OTU種數(shù)量進(jìn)入一個增長緩慢趨于平緩階段。從Shannon指數(shù)稀釋曲線（圖5b）中可看出，當(dāng)序列數(shù)量到達(dá)2 000時，Shannon指數(shù)曲線已達(dá)到平臺期，即表明曲線趨近于平緩，說明隨測序深度增加，出現(xiàn)的細(xì)菌新屬開始減少，同時新檢測到細(xì)菌屬己不再是該生境中優(yōu)勢細(xì)菌。

圖5 豐度及Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.5 Richness and Shannon rarefaction plot

如圖6所示，4個樣品共產(chǎn)生11 010個OTU，試驗(yàn)組1~4土樣所包含OTU數(shù)目分別為3 255、2 970、2 324和2 641。僅有950個OTU同時出現(xiàn)在4組土樣中，由此可推論脫水污泥生物炭（S500）和大豆秸稈生物炭（D500）投加改變污染土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)，提高Cr（Ⅵ）污染與空白（CK）細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)相似性。

圖6 不同處理土壤細(xì)菌OTU分布Fig.6 Distribution of soil bacteria OTU in different treatments

本研究確定在Cr（Ⅵ）污染條件下，土壤中不同來源生物炭對Cr（Ⅵ）污染修復(fù)后引起土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)組成變化。通過高通量測序技術(shù)對土壤樣品16S rRNA作基因測序。第30天時采集土壤樣品，各樣本數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計見表1。共獲得178 433個高質(zhì)量細(xì)菌V3~V4 Illumina序列，每個讀數(shù)范圍為58 655至62 117個序列，用于進(jìn)一步分析。97%序列相似度水平下，可發(fā)現(xiàn)在質(zhì)量控制之后剩余reads數(shù)目中試驗(yàn)組1>試驗(yàn)組2>試驗(yàn)組4>試驗(yàn)組3。物種豐度通過Chao1指數(shù)與ACE指數(shù)高低體現(xiàn)，試驗(yàn)組1物種豐度高于試驗(yàn)組2，且二者均高于試驗(yàn)組3與4。

表1 各樣本數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計Table 1 Statistics of each sample data

各樣本中土壤細(xì)菌多樣性由Shannon指數(shù)估算，試驗(yàn)組1多樣性高于試驗(yàn)組2，且二者均高于試驗(yàn)組3與4。比較4組樣本Shannon指數(shù)可知，4個土壤樣本中細(xì)菌群落多樣性排序?yàn)椋涸囼?yàn)組1>試驗(yàn)組2>試驗(yàn)組4>試驗(yàn)組3。研究發(fā)現(xiàn)生物炭本身含有大量有機(jī)物質(zhì)，具有比表面積大和多孔隙結(jié)構(gòu)等特性，其特性改善土壤結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)土壤pH，為微生物提供適宜生存環(huán)境，提高細(xì)菌種群多樣性。

2.4 大豆秸稈生物炭與脫水污泥生物炭對土壤細(xì)菌門影響分析

基于OTU物種分類結(jié)果，在門分類級別上分析各樣本中細(xì)菌種類和相對豐度。如圖7a所示，添加大豆秸稈生物炭與脫水污泥生物炭后對樣品中細(xì)菌豐度影響較大。土壤樣品中細(xì)菌在門水平上分類大致相同，但比例略有不同。4個樣品中，變形桿菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroide?tes）以及酸桿菌門（Acidobacteria）占比超過土壤門豐度75.01%，與丁自立研究發(fā)現(xiàn)重金屬污染土壤對不同重金屬污染修復(fù)的細(xì)菌菌落主要分為三大類（變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門）結(jié)果一致[8]；其中變形桿菌門（Proteobacteria）在試驗(yàn)組3中占比為62.06%；試驗(yàn)組4中占比為55.19%；在試驗(yàn)組1中占比為47.10%；在試驗(yàn)組2中占比為55.35%，結(jié)果表明，鉻處理改變土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)組成，大豆秸稈生物炭與脫水污泥生物炭施加使受污染土壤恢復(fù)至無污染土壤水平。施用生物炭處理后擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）群落豐度增加，可能是由于生物炭孔徑結(jié)構(gòu)對細(xì)菌起“庇護(hù)”作用，生物炭孔徑結(jié)構(gòu)比土壤更豐富，更好為細(xì)菌提供居住場所，使大量細(xì)菌附著于生物炭表面。以上結(jié)果表明生物炭對土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)具有一定積極影響。

圖7 細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)和物種豐度Fig.7 Bacterial population structure and species abundance

2.5 大豆秸稈生物炭與脫水污泥生物炭對土壤細(xì)菌屬影響分析

圖7b為每組土壤樣品中微生物在屬水平分布情況。通過各組土樣之間屬水平上物種多樣性比較可發(fā)現(xiàn)，鞘安醇桿菌屬（Sphingomonassp.）、芽孢桿菌屬（Bacillusssp.）、交替赤桿菌屬（Altereryth?robactersp.）等生長狀況良好，可能是由于生物炭孔徑結(jié)構(gòu)比土壤更易為細(xì)菌提供居住場所，使大量細(xì)菌附著于生物炭表面；紅育菌屬（Ramlibactersp.）、甘蔗糖菌屬（Saccharibacteria-genera-incer?tae-sedissp.）物種豐度呈下降趨勢，可能是因土壤中存在Cr（Ⅵ）污染，該菌屬對Cr（Ⅵ）敏感，導(dǎo)致部分菌屬處于被抑制狀態(tài)。這種現(xiàn)象可能與生物炭吸附選擇性有關(guān)。

試驗(yàn)組1~4相比鞘安醇桿菌屬（Sphingomonassp.）、芽孢桿菌屬（Bacillusssp.）、交替赤桿菌屬（Altererythrobactersp.）等在Cr（Ⅵ）污染土壤中均可生長，表明其強(qiáng)耐受能力；在本研究中鞘安醇桿菌屬、芽孢桿菌屬與交替赤桿菌屬等是污染土壤中優(yōu)勢菌屬，且環(huán)境中Cr（Ⅵ）還原菌數(shù)量遠(yuǎn)低于耐受菌，所以Cr（Ⅵ）耐受機(jī)制在環(huán)境中應(yīng)用更廣泛。

3 討論與結(jié)論

生物炭結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，以及生物炭對土壤性質(zhì)影響被大量研究[9]。生物炭在實(shí)際修復(fù)過程中對土壤微生物影響尚不明確。土壤微生物是土壤中生物群落重要組成且在土壤改良方面有重要作用[10]，是土壤健康重要指標(biāo)[11-12]。本研究證明生物炭施加改變土壤群落豐度及多樣性，對細(xì)菌群落組成有顯著影響，且可恢復(fù)污染地區(qū)土壤微生物種類和豐度，促進(jìn)污染地區(qū)土壤改良。生物炭因其固有多微孔結(jié)構(gòu)、較大比表面積等特征，施入土壤后為細(xì)菌提供棲息場所并保護(hù)其生命活動[13]，促進(jìn)微生物生長。

鞘安醇桿菌屬（Sphingomonassp.）、芽孢桿菌屬（Bacillusssp.）、交替赤桿菌屬（Altererythrobactersp.）等是Cr（Ⅵ）污染土壤中優(yōu)勢菌屬，這一結(jié)果與姜蒙研究重金屬污染土樣中篩選耐受細(xì)菌結(jié)果一致[14]；芽孢桿菌屬（Bacillusssp.）具有較強(qiáng)Cr（Ⅵ）還原性，與馮淏得出鉻耐受還原菌研究結(jié)果一致[15]；環(huán)境中Cr（Ⅵ）還原菌數(shù)量遠(yuǎn)低于耐受菌，所以Cr（Ⅵ）耐受機(jī)制在環(huán)境中應(yīng)用更廣泛，且研究表明，耐受Cr（Ⅵ）細(xì)菌往往可耐受多種其他重金屬[8]，說明Cr（Ⅵ）耐受菌在應(yīng)對復(fù)合重金屬污染方面具有巨大潛能，本研究對重金屬耐受菌屬分離和篩選具有指導(dǎo)意義。不同來源生物炭處理使Cr（Ⅵ）污染土壤中細(xì)菌種群多樣性有所恢復(fù)，且由于生物炭制備來源不同，土壤中細(xì)菌種群多樣性恢復(fù)情況也不同。經(jīng)兩種脫水污泥生物炭與大豆秸稈生物炭處理后Cr（Ⅵ）污染土壤中細(xì)菌種群多樣性均與未污染組相似，群落結(jié)構(gòu)恢復(fù)至無污染水平，但仍有物種豐度呈下降趨勢細(xì)菌，可能是由于制備過程粗糙、原料來源不一，表面基團(tuán)種類和性質(zhì)有限等缺點(diǎn)造成，因此需通過改性方法賦予生物炭某些特性，提高生物炭對污染物去除效率，提升生物炭實(shí)際修復(fù)效果。

受污染地區(qū)植物生長狀況反映受污染地區(qū)修復(fù)程度及修復(fù)后土壤質(zhì)量[16]，本研究中經(jīng)兩種生物炭修復(fù)土壤中生長植物各項(xiàng)指標(biāo)均顯著優(yōu)于受污染土壤中植物各項(xiàng)指標(biāo)，且是經(jīng)D500修復(fù)后，植物長勢甚至優(yōu)于未污染土壤中植物長勢。這可能與生物炭促進(jìn)土壤中微生物豐度密切相關(guān)，微生物可促進(jìn)土壤中營養(yǎng)物質(zhì)積累，改善土壤性質(zhì)從而促進(jìn)植物生長。然而在實(shí)際修復(fù)過程中生物炭對微生物生長促進(jìn)機(jī)制及對植物生長促進(jìn)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，生物炭施加為微生物創(chuàng)造良好生存環(huán)境，提高土壤中微生物豐度，刺激微生物活動和生長，這有利于土壤有機(jī)質(zhì)分解、提高土壤肥力、促進(jìn)植物生長，對土壤生態(tài)環(huán)境具有積極意義。