遠(yuǎn)端缺血后處理防治胃粘膜損傷的實(shí)驗(yàn)觀察

汪濤，周業(yè)庭，朱安祥，陳新年，周巧林

缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury,IRI)可通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)量自由基和/或活性氧族(ROS)，引發(fā)胃腸道粘膜損傷[1]。早期研究結(jié)果表明，通過(guò)短暫夾閉大鼠腹腔動(dòng)脈引發(fā)的IR可導(dǎo)致胃粘膜損傷且伴隨有大量自由基的產(chǎn)生[2]。遠(yuǎn)端缺血后處理(remote ischemic postconditioning，RIP)可減少急性心肌梗塞后心肌梗死面積[3]、減輕局灶性腦缺血后腦損傷[4]和下肢I(xiàn)RI后肺損傷[5]。雖RIP對(duì)重要臟器(心、肺和腦)的保護(hù)作用已明確，但其對(duì)肢體IR誘發(fā)胃粘膜損傷的影響及作用機(jī)制尚不清楚。為此，本研究在筆者前期研究[6]基礎(chǔ)上，觀察RIP對(duì)大鼠肢體IR誘發(fā)胃粘膜損傷的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康成年雄性Wistar大鼠108只，體質(zhì)量220～250 g，來(lái)自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。標(biāo)準(zhǔn)條件(室內(nèi)12 h晝夜循環(huán)、溫度22 ℃～24 ℃)下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對(duì)照組(C組)、缺血再灌注組(IR組)及遠(yuǎn)端缺血后處理組(RIP組)，每組36只。

1.2 肢體IRI模型的制備及分組處理 參照文獻(xiàn)[7-8]方法制備肢體IRI模型，模型制備前禁食12 h，飲水自由。吸入2%～3%異氟醚淺麻醉，將大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，應(yīng)用市售彈力橡皮筋(直徑2.5 cm)環(huán)扎大鼠雙下肢近心端(壓力290～310 mmHg)3 h，再灌注24 h。C組不阻斷血流；IR組阻斷血流；RIP組阻斷血流并于再灌注即刻對(duì)雙下肢近心端重復(fù)進(jìn)行3次30 s再灌注、30 s缺血；除C組外，其余各組均再灌注24 h。

1.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)測(cè)定 分別于再灌注0 h(T0)、1 h(T1)、3 h(T2)、6 h(T3)、12 h(T4)和24 h(T5)采集下腔靜脈血后即刻放血、處死大鼠；取胃小彎側(cè)胃粘膜組織，等分為2份，分別置于-20 ℃冰箱存放和用4%中性甲醛固定備用。(1)取血清，按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書，于721型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)上采用比色法測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的活性，于SM-3自動(dòng)化酶免分析儀(北京天石醫(yī)療用品制作所)上采用ELISA法測(cè)定TNF-α和IL-10的濃度。(2)取凍存的胃粘膜組織，制備10%組織勻漿，按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書，于721型分光光度計(jì)上采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性，鄰聯(lián)茴香胺比色法測(cè)定髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性，考馬斯亮藍(lán)蛋白法檢測(cè)組織蛋白濃度，化學(xué)比色法測(cè)定黃嘌呤氧化酶(XOD)活性，硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定丙二醛(MDA)含量。(3)取4%甲醛固定的胃粘膜組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察胃粘膜組織病理學(xué)變化，采用胃粘膜損傷指數(shù)評(píng)分[9]來(lái)評(píng)價(jià)胃粘膜組織的損傷情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：胃粘膜上皮累積損傷長(zhǎng)度范圍≤1 mm，1分；>1 mm和≤2 mm，2分；>2 mm和≤3 mm，3分；對(duì)損傷寬度>1 mm，損傷評(píng)分加倍。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血清中LDH、CK活性和TNF-α、IL-10濃度比較 與C組比較，IR和RIP組血清LDH、CK活性及TNF-α、IL-10濃度升高(P<0.05)；與IR組比較，RIP組血清LDH、CK活性及TNF-α濃度均于再灌注6 h時(shí)顯著降低，而RIP組IL-10濃度于再灌注3h時(shí)顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清LDH、CK活性和TNF-α 、IL-10濃度比較

2.2 3組大鼠胃粘膜組織中SOD、MPO、XOD活性和MDA含量比較 與C組比較，IR和RIP組胃粘膜組織中SOD活性降低，MPO、XOD活性及MDA含量升高(P<0.05)；與IR組比較，RIP組SOD活性于再灌注6 h時(shí)升高，MPO、XOD活性及MDA含量均于再灌注6 h時(shí)降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠胃粘膜組織SOD、MPO、XOD活性和MDA含量比較

1A 對(duì)照組 1B 缺血再灌注組 1C 遠(yuǎn)端缺血后處理組 1D 3組胃粘膜損傷指數(shù)(與C組比較，★P<0.05；與IR組比較，▲P<0.05)。圖1 光鏡下3組T3亞組動(dòng)物胃粘膜組織病理學(xué)變化(HE×400)及胃粘膜損傷指數(shù)評(píng)分。

2.3 胃粘膜組織病理學(xué)改變 與C組比較，IR和RIP組再灌注6h后見部分胃粘膜肌層與腺體間嗜酸性粒細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或部分胃粘膜與腺體間少許嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、偶見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血并粘膜深層少量出血或間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，胃粘膜組織損傷明顯及其損傷評(píng)分升高(P<0.05)；與IR組比較，RIP組再灌注6 h后胃粘膜組織損傷減輕及其損傷評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見圖1。

3 討論

肢體IRI是日常生活中非常普遍現(xiàn)象，不僅使缺血組織(骨骼肌)出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷，而且可引致遠(yuǎn)端器官(心、肺、肝、腎及胃腸道)損傷[10-11]。本研究參照文獻(xiàn)[7-8]，應(yīng)用市售彈力橡皮筋(直徑2.5 cm)環(huán)扎大鼠雙下肢近心端(壓力290～310 mmHg)3 h后再灌注24 h的方法制備肢體IRI模型。結(jié)果表明，與C組比較，IR組血清LDH、CK活性升高且可見部分胃粘膜肌層與腺體間嗜酸性粒細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)血管擴(kuò)張充血及粘膜深層少量出血，說(shuō)明肢體IRI導(dǎo)致胃粘膜損傷模型制備成功。

ROS、內(nèi)皮素、微循環(huán)障礙、多形核白細(xì)胞(PMN)浸潤(rùn)及NO釋放[12-13]等在氧化應(yīng)激和IRI誘發(fā)的胃粘膜損傷病理機(jī)制中起著決定性的作用，可導(dǎo)致胃粘膜組織損傷和功能障礙。缺血后處理是一種有效的、非侵入性治療技術(shù)[14]，可減輕下肢大血管手術(shù)期間引發(fā)的不同器官(肺、腎)IRI。近年來(lái)隨著缺血后處理概念的演變及延伸，RIP日益被應(yīng)用到不同組織器官缺血的保護(hù)研究。有研究已證實(shí)，RIP可通過(guò)降低ROS產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子釋放和促進(jìn)抗炎因子產(chǎn)生及改善微循環(huán)功能和細(xì)胞能量代謝，減少急性心肌梗塞后心肌梗死面積[3]、減輕局灶性腦缺血后腦損傷[4]、下肢I(xiàn)RI后肺損傷[5]及腸道損傷[6]。

本研究結(jié)果顯示，IR組胃粘膜組織中SOD活性降低，XOD和MPO活性及MDA含量升高，提示肢體IRI可引起胃組織抗氧化能力降低，ROS產(chǎn)生增多和細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致胃組織的氧化性損傷；而RIP組SOD活性升高，XOD和MPO活性及MDA含量降低，提示RIP可提高機(jī)體的抗氧化能力，減少ROS的生成，維持機(jī)體氧化-抗氧化穩(wěn)定及降低細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，以減輕胃組織的氧化損傷。另外，本研究中肢體IRI誘發(fā)胃粘膜水腫及上皮出血，間質(zhì)充血，糜爛和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化發(fā)生于肢體IR后6 h，此與Brzozowska等[15]的研究結(jié)果相一致。

TNF-a通過(guò)激活PMN及上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞和粒細(xì)胞中粘附分子的表達(dá)在全身性炎癥反應(yīng)中起著重要作用[16]，可間接造成或加重胃IRI[17]；IL-10可通過(guò)抑制細(xì)胞因子(TNF-α和IL-6)的釋放和PMN在組織器官的聚積來(lái)減輕組織IRI[18]。本研究結(jié)果顯示，IR組血清TNF-α、IL-10含量升高，提示肢體IRI誘發(fā)的胃IRI可引起胃粘膜組織中PMN浸潤(rùn)、聚積而導(dǎo)致胃粘膜組織的炎性損傷；而RIP組血清TNF-α含量降低、IL-10含量升高，表明RIP可抑制PMN在胃組織中的激活、聚集和大量炎癥因子的釋放及促炎因子的產(chǎn)生，從而減輕胃粘膜組織的炎性損傷。

綜上所述，RIP可減輕肢體IRI誘發(fā)的胃粘膜損傷，有益于恢復(fù)和維持胃粘膜組織結(jié)構(gòu)的完整性，作用機(jī)制可能與減少ROS的產(chǎn)生、抗炎和抗氧化效應(yīng)等有關(guān)。