應(yīng)用QuEChERS結(jié)合UPLC－Q－Orbitrap HRMS法測(cè)定小麥粉真菌毒素方法研究

向俊 陳同強(qiáng)

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物，不易被破壞，即使對(duì)食物進(jìn)行烹調(diào)、加熱或加工等也很難根除。過度服用真菌毒素會(huì)誘發(fā)機(jī)體的癌變、畸形和突變，導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制、生殖紊亂和器官損傷，對(duì)人類以及動(dòng)物的生命安全及生活健康造成嚴(yán)重威脅。

當(dāng)前主要采用酶聯(lián)免疫吸附法、毛細(xì)管電泳法等開展真菌毒素的檢測(cè)工作，這些檢測(cè)方法成本低廉、操作方便、易于推廣，但靈敏度差、假陽(yáng)性率高，并且檢測(cè)對(duì)象單一，只能針對(duì)一種或一類真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法滿足真菌毒素在痕量水平下的高通量檢測(cè)需求。UPLC-Q-Orbitrap HRMS法是超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電軌道離子阱質(zhì)譜法的簡(jiǎn)稱，這種檢測(cè)方法是質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的分支，通過結(jié)合四級(jí)桿所具有的高選擇性，以及離子阱所具有的高靈敏度和高分辨率，可以讓目標(biāo)物的檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，有效拓寬檢測(cè)對(duì)象，適用于真菌毒素的高通量篩查。

本實(shí)驗(yàn)以QuEChERS結(jié)合UPLC-Q-Orbitrap HRMS法對(duì)小麥粉的5種真菌毒素進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，其線性范圍是0.25μg/L-100μg/L，定量限范圍是0.30μg/kg-3.00μg/kg，在低添加水平、中添加水平和高添加水平下的平均回收率是70.2%-112.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.2%-4.5%。以上數(shù)據(jù)表明，QuEChERS結(jié)合UPLC-Q-Orbitrap HRMS法適合作為小麥粉真菌毒素檢測(cè)中高通量篩查和確認(rèn)檢測(cè)的方法。

一、實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

1.試劑。黃曲霉毒素B1（下文簡(jiǎn)稱AFB1）、黃曲霉毒素B2（下文簡(jiǎn)稱AFB2）、黃曲霉毒素G1（下文簡(jiǎn)稱AFG1）、黃曲霉毒素G2（下文簡(jiǎn)稱AFG2）、黃曲霉毒素M1（下文簡(jiǎn)稱AFM1）等5種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)溶液，甲醇、乙腈、甲酸、乙酸等為色譜純。

2.設(shè)備。QuEChERS提取鹽包，dSPE凈化管，GHP針式過濾器等;超高效液相色譜儀，電子天平，移液器，多功能旋渦混合器，數(shù)控超聲波清洗器，離心機(jī)，智能氮吹儀。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.色譜條件。色譜柱選擇100mm×2.1mm，規(guī)格1.8μm，進(jìn)樣量5.0μL，柱溫35℃，A相與B相分別選擇乙酸銨溶液和甲醇，梯度洗脫條件如表1所示。

2.質(zhì)譜條件。采用正離子模式進(jìn)行掃描，采用數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描采集，鞘氣流量和輔助氣流量分別為40arb和10arb，噴霧電壓3.8kv，離子源溫度350℃，毛細(xì)管溫度320℃。5種真菌毒素的質(zhì)譜信息如表2所示。

3.樣品處理。（1）選擇50mL聚四氟乙烯離心管，稱取2.0g試樣置于離心管中，加入水5.0mL，用渦旋方式讓樣品得到充分浸潤(rùn);加入2.0%的甲酸乙腈溶液10mL，渦旋振蕩2min，超聲10min;加入QuEChERS提取鹽包，繼續(xù)振搖1min;在10000r/min條件下，離心5min。（2）取8.0mL上清液轉(zhuǎn)移到dSPE凈化管內(nèi)，dSPE凈化管中事先加入復(fù)合吸附劑，渦旋1min;在10000r/min條件下，離心5min。（3）取5.0mL上清液轉(zhuǎn)移到氮吹管內(nèi)，在40℃水浴下吹干氮?dú)夂蠹尤雰?nèi)標(biāo)溶液，取80%甲醇水溶液，定容1.0mL，渦旋振蕩時(shí)間1min，過0.22μm濾膜，用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定工作。（4）測(cè)定完成后，使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)測(cè)定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)完成后用Origin軟件繪圖。

三、測(cè)定結(jié)果

分別以所選擇真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和相應(yīng)的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，用線性回歸作為計(jì)算方式，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)后確定線性范圍、檢出限與定量限，結(jié)果如表3所示。

根據(jù)5種真菌毒素在小麥粉基質(zhì)中的定量限，設(shè)計(jì)低濃度水平、中濃度水平和高濃度水平三個(gè)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表4所示。

四、結(jié)論

QuEChERS結(jié)合UPLC-Q-Orbitrap HRMS法測(cè)定小麥粉中的5種真菌毒素解決了基質(zhì)干擾問題，使測(cè)定結(jié)果的定性和定量準(zhǔn)確性都得到了顯著提升。因此，本測(cè)定方法可以適用于小麥粉中真菌毒素的快速篩查及定量測(cè)定，進(jìn)一步提高食品安全的保障程度。（基金項(xiàng)目：食品安全快速檢測(cè)與溯源關(guān)鍵技術(shù)研究與示范，編號(hào)：2020SK2128。）

作者簡(jiǎn)介：向?。?984-），女，土族，湖南湘西，碩士，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)。