聽(tīng)力損失中表達(dá)上調(diào)的miR-196a-5p靶向抑制Neuritn的表達(dá)

宋銀,張雪,孫嘉偉,黃娟,胡金池,楊磊,黃瑾*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832003;2 杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)部,浙江 杭州 310036)

聽(tīng)力損失(Hearing loss)是一種常見(jiàn)的疾病,是指是人耳在某一頻率的聽(tīng)閾比正常聽(tīng)閾高出若干分貝數(shù)。根據(jù)《全球疾病負(fù)擔(dān)研究》[1]的統(tǒng)計(jì),聽(tīng)力損失是全球第四大致殘?jiān)?同時(shí)WHO的數(shù)據(jù)顯示,2019年全球致殘性耳聾達(dá)4.66億,預(yù)計(jì)到2050年將超過(guò)9億,而且65歲以上的人有三分之一受到聽(tīng)力損失的影響。聽(tīng)力損失不僅影響與他人溝通的能力,引起人的孤獨(dú)感,還與老年癡呆[2],精神疾病[3]等相關(guān)。除此之外,聽(tīng)力損失還會(huì)對(duì)經(jīng)濟(jì)造成不良影響。我國(guó)正步入老齡化社會(huì),面臨聽(tīng)力損失風(fēng)險(xiǎn)的人群正在逐年增加,需要我們時(shí)刻關(guān)注聽(tīng)力變化趨勢(shì),制定防治聽(tīng)力損失的策略。

聽(tīng)力損失可分為傳導(dǎo)性,感覺(jué)神經(jīng)性和混合性三種類型。感覺(jué)神經(jīng)性聽(tīng)力損失(SNHL)發(fā)生在耳蝸感覺(jué)毛細(xì)胞和/或神經(jīng)結(jié)構(gòu)受損,占聽(tīng)力損失的大多數(shù)情況[4]。造成聽(tīng)力損失的原因有很多,主要是衰老、遺傳突變、噪聲暴露、接觸具有耳毒性副作用的治療藥物以及慢性病等因素[5]。目前尚無(wú)有效恢復(fù)聽(tīng)力的藥物,感音性聽(tīng)力損失的治療多采用人工耳蝸替代療法,但并不是每個(gè)聽(tīng)力損失患者都適用,人工耳蝸的使用需要患者仍有一定數(shù)量存活的有功能的毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元[6]。目前對(duì)聽(tīng)力損失的治療研究集中于耳蝸局部遞送藥物,基因[7]和基于細(xì)胞[8]的療法,其中基于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的藥物療法前景良好。

Neuritin是與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,能夠明顯促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)及其分支形成、以及突觸的發(fā)育成熟[9-10],調(diào)節(jié)突觸回路的形成[11];并可抑制凋亡,維持神經(jīng)元的存活[12],參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,其表達(dá)與損傷后的神經(jīng)再生和修復(fù)、學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),藥物性聽(tīng)力損失后小鼠耳蝸Neuritin的表達(dá)降低,而通過(guò)給予小鼠外源性Neuritin蛋白后小鼠毛細(xì)胞損傷減輕,并可使聽(tīng)功能有一定恢復(fù)。不僅如此,在噪聲造成的隱性聽(tīng)力損失中,我們給予外源Neuritin蛋白后發(fā)現(xiàn)噪聲造成的聽(tīng)力損失程度有所減輕。根據(jù)此現(xiàn)象,我們推測(cè)Neuritin蛋白對(duì)聽(tīng)力損失可能具有改善作用。

MicroRNA或miRNA被定義為一組非編碼的短鏈RNA,有助于調(diào)節(jié)基因表達(dá)[14]。自從1993年被發(fā)現(xiàn)以來(lái),已經(jīng)鑒定出許多在內(nèi)耳和外耳的正常發(fā)育中起作用的miRNA[15-16]。由于研究表明脊椎動(dòng)物中的大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因均受miRNA調(diào)控,因此miRNA在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)中調(diào)控mRNA的能力值得進(jìn)一步研究[17-18]。同樣,由于人類轉(zhuǎn)錄組的大部分受miRNA調(diào)控,因此它們可用于診斷和預(yù)后以及開(kāi)發(fā)藥物。在臨床試驗(yàn)中,正在研究使用抗miRNA LNA(miravirsen)和模擬miRNA(MRX34)的分子療法[19]。Neuritin作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,本質(zhì)是一種小分子蛋白質(zhì),也會(huì)受到miRNA的調(diào)控,但在耳蝸中受到哪些miRNA調(diào)控我們并未知曉。為此本文主要探索了聽(tīng)力損失中可能調(diào)控Neuritin表達(dá)的miRNA。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水合氯醛(生工,A600288),Furosemide(Sigma,PHR1057),硫酸卡那霉素(Biosharp,BS152),DMSO(Sigma,D4540),TRNzol Universal ageant(天 根,DP424),Anti-Neuritin(Abcam,ab64186),Anti β-Actin(北京中杉金橋,TA-09),Lipofectamine 3000(ThermoFisher,L3000015),山羊抗兔二抗(北京中杉金橋),山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋),Prime-ScriptTMRT reagent Kit(Takara RR 037 A),TB Green? Premix Ex TaqTMII(Takara RR 820 A),RIPA(Beyotime,P0013B),PVDF膜(Immobilon,ISEQ00010),脫脂奶粉(Biosharp,BS 102),ECL Western Blotting Substrates(BI0-RAD,1705061)。

1.2 聽(tīng)力損失模型構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)使用動(dòng)物品系為CBA小鼠(SPF級(jí)),所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究采取硫酸卡那霉素聯(lián)合呋塞米(速尿)的方法,建立急性、重型感音神經(jīng)性耳聾模型。給藥方式:每只小鼠皮下注射卡那霉素1 000 mg·kg-1,半小時(shí)后腹腔注射呋塞米500 mg·kg-1。藥物配置:使用1 g硫酸卡那霉素溶解于10 mL生理鹽水配制0.1 g·mL-1硫酸卡那霉素;使用0.5 g呋塞米溶于1 mL DMSO,然后加入0.75 mL NaoH(2 mol·L-1),最后加生理鹽水定容至10 mL配制0.05 g·mL-1呋塞米。實(shí)驗(yàn)分組:取45只聽(tīng)力正常的2月齡CBA小鼠(不區(qū)分性別),隨機(jī)將其分為3組,每組15只:第一組給予生理鹽水,第二組使用藥物損傷12 h,第三組使用藥物損傷24 h。

1.3 聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試(ABR)

給予每只CBA小鼠4.25%(425 mg·kg-1)水合氯醛腹腔注射麻醉后置標(biāo)準(zhǔn)屏蔽隔音室內(nèi),以聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位(ABR)測(cè)試聽(tīng)閾,短聲刺激,掃描時(shí)程10 ms,刺激重復(fù)率11 次·s-1,濾波帶通為150—1 500 Hz,疊加500—1 000次。以Ⅱ波閾值作為ABR閾值,每只分別測(cè)雙耳。

1.4 耳蝸取材及RNA提取

取材前使用4.25%水合氯醛麻醉小鼠,待小鼠麻醉后脫頸處死。使用組織剪剪斷小鼠頭部,然后沿顱骨正中線剪開(kāi)小鼠頭部皮膚,接著剪開(kāi)小鼠左右兩側(cè)顱骨,挑出腦組織,在耳蝸位置取出左右兩側(cè)的耳蝸并去除蝸殼及周邊組織。將取出的耳蝸用鑷子在解剖顯微鏡下迅速剝離小鼠耳蝸外側(cè)骨性結(jié)構(gòu),取出Corti器,6個(gè)Corti器為一組,液氮研磨,研成粉末使用小勺移入1.5 mL EP管,接著使用TRNzol Universal ageant提取總RNA。

1.5 miRNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析

使用RNA-seq方法進(jìn)行miRNA測(cè)序,每個(gè)樣本測(cè)序深度為20 mol·L-1。對(duì)測(cè)序得到的miRNA使用DEG-seq方法進(jìn)行分析,篩選表達(dá)出現(xiàn)差異的miRNA,篩選標(biāo)準(zhǔn)為log2FC＞1和Qvalue＜0.001。篩選出12 h組與24 h共同上調(diào)的miRNA作為候選miRNA。接著從7個(gè)不同的網(wǎng)站(TargetScan,miRDB,DIANA,miRNAMap,miRWalK,miRmap,trabase)以“NRN1”為關(guān)鍵詞預(yù)測(cè)靶向Neuritin基因的miRNA,然后與候選miRNA取交集得到可能靶向調(diào)控Neuritin且在聽(tīng)力損失過(guò)程中上調(diào)的候選miRNA。

1.6 實(shí)時(shí)定量熒光PCR (RT-qPCR)

使用莖環(huán)法合成候選miRNA引物(吉瑪基因公司),同時(shí)使用U6作為內(nèi)參。按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara RR 037 A)10 μL體系(5×PrimeScript Buffer 2 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL,PCR Reverse Primer 0.5 μL,Total RNA 2 μL,ddH2O 5 μL)將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,循環(huán)條件為:95 ℃ 30 s(1次循環(huán)),95 ℃ 5s,60 ℃ 30 s(40次循環(huán))。按照Takara qPCR試劑盒(Takara RR 820 A)20 μL體系(TB Green Premix Ex Taq II 10 μL,PCR Forward Primer 0.8 μL,PCR Reverse Primer 0.8 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 6.4 μL)對(duì)得到的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,循環(huán)條件為95 ℃ 30 s(1次循環(huán)),95 ℃ 5s,60 ℃ 30 s(40次循環(huán))。使用熒光定量PCR儀檢(德國(guó)analytik-jena 870wer 3G)測(cè)樣品熒光,計(jì)算CT值,TM值。使用△△t方法計(jì)算候選miRNA在12 h組、24 h組與對(duì)照組之間的差異表達(dá)倍數(shù),按差異倍數(shù)篩選目標(biāo)miRNA。

1.7 免疫印跡

首先合成候選miRNA的mimics(吉瑪基因公司),然后使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher,L3000015)將mimics轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后使用RIPA(Beyotime,P0013B)裂解細(xì)胞提取總蛋白。配置15%濃度的SDS-PAGE凝膠,按80 V 30 min,110 V 90 min條件在SDS-PAGE凝膠上分離出大約60-100ug的蛋白質(zhì),然后按23 V 43 min條件使用半干轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Immobilon,ISEQ00010)上。使用5%脫脂奶粉(Biosharp,BS 102)將PVDF膜封閉2 h,然后使用5%脫脂奶粉按1∶1 000比例稀釋Neuritin抗體(Abcam,64186),4 ℃孵育過(guò)夜,第二天按1∶10000比例稀釋山羊抗兔二抗(中杉金橋),室溫孵育2 h,洗膜后使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(BIO-RAD,1705060)可視化免疫反應(yīng)帶。

2 結(jié)果

2.1 小鼠藥物性聽(tīng)力損失模型構(gòu)建與鑒定

CBA小鼠是常用的聽(tīng)力損失模型小鼠,我們選擇了聽(tīng)力正常的2月齡CBA小鼠,使用卡那霉素(1000 mg·kg-1)和呋塞米(500 mg·kg-1)構(gòu)建了聽(tīng)力損失模型[20-21],同時(shí)對(duì)照組給予等量生理鹽水。小鼠模型建立前后對(duì)小鼠進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠聽(tīng)力閾值無(wú)變化,造模小鼠聽(tīng)力閾值上調(diào)60-80 dB(圖1A),說(shuō)明小鼠聽(tīng)力損失模型構(gòu)建成功。

圖1 硫酸卡那霉素和呋塞米聯(lián)用造模后小鼠聽(tīng)功能檢測(cè)結(jié)果

2.2 小鼠聽(tīng)力損失上調(diào)miRNA差異表達(dá)分析

小鼠Corti器總RNA提取成功后,使用RNAseq方法進(jìn)行小RNA測(cè)序,測(cè)序深度為20 M。將測(cè)序結(jié)果按照DEG-seq方法分析,以|log2FC|＞1,Qvalue＜0.01為閾值進(jìn)行篩選,結(jié)果顯示:在12 h組得到了80個(gè)顯著上調(diào)的miRNA,169個(gè)顯著下調(diào)的miRNA(圖2A);在24 h組得到了40上調(diào)的miRNA,94個(gè)下調(diào)的miRNA(圖2C)。

圖2 聽(tīng)力損失小鼠測(cè)序結(jié)果差異miRNA分析

2.3 目標(biāo)miRNA篩選

取Treated 12 h組和Treated 24 h組上調(diào)miRNA交集得到了24個(gè)在兩組中共同表達(dá)上調(diào)的miRNA。使用7個(gè)生信網(wǎng)站(TargetScan,miRDB,DIANA,miRNAMap,miRWalK,miRmap,trabase)預(yù)測(cè)靶向Neuritin的miRNA,得到1533個(gè)miRNA。將1533個(gè)miRNA與共同上調(diào)的miRNA取交集,篩選出15個(gè)靶向neuritin且在聽(tīng)力損失過(guò)程中上調(diào)的候選miRNA,依照l(shuí)og2FC值取前三名作為目標(biāo)miRNA包括miR-196a-5p,miR-211-5p,miR-6395。

表2 聽(tīng)力損失中上調(diào)且靶向Neuritin的15個(gè)miRNA

2.4 通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR確定目標(biāo)miRNA

高通量測(cè)序結(jié)果往往存在誤差,為了鑒定目標(biāo)miRNA在聽(tīng)力損失中的真實(shí)表達(dá)情況,本研究使用了實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-qPCR)檢測(cè)目標(biāo)miRNA在聽(tīng)力損失小鼠耳蝸Corti器中的表達(dá)情況,并且使用U6作為內(nèi)參。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示:3個(gè)候選miRNA中miR-196a-5p在小鼠造模12 h和24 h組中均表達(dá)升高(P＜0.05),miR-211-5p在12 h組和24 h組的表達(dá)下降(P＜0.05),miR-6395在造模12 h組表達(dá)下降而24 h組表達(dá)升高(P＜0.05)(圖4 A)。RT-qPCR作為檢測(cè)miRNA的一種方法,其精密度高于高通量測(cè)序,得到的結(jié)果可信度更高。根據(jù)RT-qPCR結(jié)果,將miR-196a-5p作為目標(biāo)miRNA進(jìn)行下一步與Neuritin相關(guān)性的鑒定。

圖4 目標(biāo)miRNA熒光定量PCR結(jié)果

2.5 目標(biāo)miRNAmiR-196a-5p對(duì)Neuritin的調(diào)控作用

對(duì)于miRNA與靶基因的預(yù)測(cè)一般使用3’UTR區(qū)域結(jié)合的方法,所得結(jié)果為預(yù)測(cè)結(jié)果,不能100%代表真實(shí)情況,所以為了鑒定miR-196a-5p與Neuritin的真實(shí)相關(guān)性,我們使用miR-196a-5p的mimics,將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞來(lái)觀察對(duì)Neuritin表達(dá)的作用。WB結(jié)果顯示:給予miR-196a-5p干預(yù)后293T細(xì)胞的Neuritin的表達(dá)出現(xiàn)了明顯下降(P＜0.05)(圖5)。

圖5 miR-196a-5p對(duì)293T細(xì)胞Neuritin表達(dá)的影響

3 討論

首先,在這項(xiàng)研究中,我們通過(guò)高通量測(cè)序篩選到了小鼠耳蝸Corti器中與聽(tīng)力損失有關(guān)的miRNA。研究中,我們使用了硫酸卡那霉素聯(lián)合呋塞米誘導(dǎo)的聽(tīng)力損失小鼠模型的Corti器進(jìn)行小RNA測(cè)序。硫酸卡那霉素聯(lián)合呋塞米誘導(dǎo)的耳毒性小鼠模型是聽(tīng)力損失實(shí)驗(yàn)的理想選擇,在注射硫酸卡那霉素和呋塞米后小鼠會(huì)發(fā)生明顯的聽(tīng)力損失(圖1)。

通過(guò)耳蝸Corti器小RNA測(cè)序,我們得到了許多在聽(tīng)力損失中表達(dá)升高的miRNA(圖2),然后基于生物信息學(xué)手段,我們選擇了7個(gè)生物信息學(xué)網(wǎng)站包括(TargetScan,miRDB,DIANA,miRNAMap,miRWalK,miRmap,trabase)預(yù)測(cè)靶向Neuritin的miRNA。網(wǎng)站預(yù)測(cè)的方法不盡相同,為了得到全面的預(yù)測(cè)結(jié)果,我們將7個(gè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果取并集,得到了靶向Neuritin的miRNA(表1),然后與聽(tīng)力損失中表達(dá)上調(diào)的miRNA取交集,得到了在聽(tīng)力損失中表達(dá)上調(diào)且靶向Neuritin的候選miRNA(圖3)。

表1 RT-qPCR所使用的引物序列。

圖3 目標(biāo)miRNA的篩選

接下來(lái)我們對(duì)篩選到的候選miRNA進(jìn)行了兩方面的驗(yàn)證:一方面使用了RT-qPCR方法鑒定候選miRNA在聽(tīng)力損失小鼠耳蝸Corti器中差異表達(dá)的真實(shí)性;另一方面使用了Western blot方法明確候選miRNA對(duì)Neuritin的靶向作用。RT-qPCR結(jié)果顯示miR-196a-5p在給藥12 h和24 h后均表達(dá)上調(diào)(P＜0.05),而miR-211-5p在給藥12 h和24 h后均表達(dá)下降(P＜0.05),miR-6395在給藥12 h后表達(dá)下降,在給藥24 h后表達(dá)上升(P＜0.05)(圖4)。只有miR-196a-5p在造模前后出現(xiàn)了明顯的表達(dá)上調(diào),所以我們選擇miR-196a-5p作為目標(biāo)miRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。我們合成miR-196a-5p的mimics,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,并使用Western blot檢測(cè)Neuritn蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示給予miR-196a-5p mimics干擾后,293T細(xì)胞的Neuritin蛋白的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的下降(P＜0.05)(圖5),說(shuō)明miR-196a-5p可以抑制Neuritin蛋白的表達(dá),由此我們可以得出結(jié)論:在聽(tīng)力損失中miR-196a-5p表達(dá)上調(diào)且可靶向抑制Neuritn的表達(dá)。

miR-196 是2002年發(fā)現(xiàn)的新miRNA[22],目前其研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)miR-196a-5p在多種腫瘤中表達(dá)發(fā)生了變化,包括胃癌[23],乳腺癌[24],胰腺癌[25],卵巢癌[26],結(jié)直腸癌[27]等。我們研究中發(fā)現(xiàn)miR-196a-5p可以抑制Neuritin的表達(dá)而在一項(xiàng)關(guān)于結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-196a-5p mimics可以抑制HCT116細(xì)胞中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)的表達(dá)[28],這提示miR-196a-5p可能在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)方面發(fā)揮作用。目前尚未見(jiàn)到miR-196a-5p與聽(tīng)力損失的相關(guān)報(bào)道,在這里我們提出關(guān)于miR-196a-5p的新見(jiàn)解:miR-196a-5p在聽(tīng)力損失中表達(dá)上調(diào),繼而靶向抑制Neuritin在耳蝸中的的表達(dá),從而加重聽(tīng)力損失的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,我們找到了聽(tīng)力損失中高表達(dá)且能靶向抑制Neuritin的關(guān)鍵miRNA:miR-196a-5p。miR-196a-5p有希望作為一個(gè)聽(tīng)力損失的新標(biāo)志物,用于聽(tīng)力損失早期的診斷和篩查,并有希望作為潛在的治療靶標(biāo),開(kāi)發(fā)治療聽(tīng)力損失的小分子藥物。