三維基因組與疾病

陳河兵 陶歡 伯曉晨 李程

人類基因組分布在染色質(zhì)上，包含約30億個堿基對，如果我們每秒朗讀一個堿基，每天讀24小時，需要一個世紀的時間才能讀完。當基因組DNA完全以線性排列方式展開時，其長度可達2米，而容納基因組的細胞核只有幾微米。這么長的DNA是如何被裝進如此微小的細胞核中的呢？在這個過程中，DNA分子必定經(jīng)歷了復(fù)雜的折疊，并在折疊的同時調(diào)控基因表達、參與機體發(fā)育，并和疾病的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)。

奇妙的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

1953年，沃森和克里克提出了DNA分子雙螺旋模型，并因此獲得了諾貝爾獎。隨著電子顯微鏡的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位——核小體。核小體由DNA纏繞組蛋白八聚體形成，并通過DNA串連起來形成直徑為11納米的“串珠”結(jié)構(gòu)。核小體螺旋化形成30納米的螺線管，進一步折疊形成300～700納米的染色質(zhì)，并在細胞分裂期濃縮形成1400納米的染色體結(jié)構(gòu)。整個過程中，基因組DNA被壓縮了8000～10 000倍，裝進細胞的遺傳信息儲存中心——細胞核中。

巧妙的高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)

近年來，科學(xué)家發(fā)明了大量的方法來研究染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，主要包括基于電子顯微鏡的熒光原位雜交相關(guān)技術(shù)，以及基于測序的染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)。而本文主要關(guān)注染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)中的Hi-C技術(shù)及其衍生技術(shù)。

Hi-C技術(shù)及Hi-C衍生技術(shù)

2009年，科學(xué)家們研發(fā)了高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)（high-through chromosome conformation capture， Hi-C），為揭示染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)提供了有力的技術(shù)支撐[1]。Hi-C技術(shù)將空間上相互作用的染色質(zhì)通過甲醛固定，然后使用限制性內(nèi)切酶切割基因組，并用生物素標記切割末端。再使用DNA連接酶連接帶有生物素富集標記的鄰近DNA片段，純化和打斷連接后的DNA分子，并篩選出帶有生物素標記的DNA片段，最后對DNA文庫進行高通量雙端測序。Hi-C技術(shù)將細胞核中染色質(zhì)空間互作的信息轉(zhuǎn)換成測序信息，從而通過快捷的測序技術(shù)實現(xiàn)了全基因水平的染色質(zhì)相互作用位點的識別。

在Hi-C技術(shù)的基礎(chǔ)上，目前已有多種Hi-C衍生技術(shù)被開發(fā)，這些方法簡化了Hi-C技術(shù)的實驗流程，降低了實驗噪聲和成本，推動了染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的研究。國內(nèi)課題組也在相關(guān)技術(shù)上取得了大量突破性進展，如高分辨率BL-Hi-C技術(shù)以及簡單高效的DLO Hi-C技術(shù)。筆者團隊也開發(fā)了不依賴于探針序列及蛋白抗體，以高效富集全基因組活躍轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件間相互作用的OCEAN-C技術(shù)[2]。此外，筆者團隊還與其他團隊合作開發(fā)了基于Tn5轉(zhuǎn)座酶擴增DNA片段的少量細胞Hi-C技術(shù)（tagHi-C）[3]。

基于Hi-C識別的染色質(zhì)多層級結(jié)構(gòu)

Hi-C技術(shù)從一個新的角度展示了染色質(zhì)的多層級結(jié)構(gòu)。結(jié)合顯微成像技術(shù)，研究者們發(fā)現(xiàn)細胞核中每條染色體傾向于占據(jù)獨立不重疊的區(qū)域，這些區(qū)域被稱為染色體疆域，疆域內(nèi)的染色質(zhì)會形成不同的區(qū)室結(jié)構(gòu)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄活性不同，這些區(qū)室可以被分為轉(zhuǎn)錄活躍的A區(qū)室及轉(zhuǎn)錄抑制的B區(qū)室，同類區(qū)室內(nèi)染色質(zhì)的相互作用較多，不同類區(qū)室間染色質(zhì)的相互作用較少。隨著測序精度的提升，研究人員發(fā)現(xiàn)區(qū)室內(nèi)部1Mb左右的DNA組成了更小的空間結(jié)構(gòu)，稱為拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域 （topologically associating domain， TAD），TAD內(nèi)一般包含8～10個基因，其內(nèi)部的DNA元件之間形成了較為緊密的相互作用，而TAD間的染色質(zhì)相互作用較少。相鄰TAD邊界上結(jié)合有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白，如CTCF蛋白（CCCTC binding factor， CTCF）和黏連蛋白的蛋白復(fù)合體，這些蛋白起到組織染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并隔離兩個相鄰的TAD之間互作的功能。TAD內(nèi)部進一步包含染色質(zhì)環(huán)，例如增強子—啟動子環(huán)。

隨著Hi-C測序技術(shù)逐步成熟，研究人員在染色質(zhì)相互作用的圖譜中，觀察到更加精細的染色質(zhì)相互作用模式，如染色質(zhì)條帶。條帶反映了環(huán)擠出模型中染色質(zhì)折疊過程中環(huán)形成時的動態(tài)情況。環(huán)擠出模型提出染色質(zhì)環(huán)的形成是由染色質(zhì)主動擠出機制介導(dǎo)的，其中CTCF蛋白附著在染色質(zhì)上并隨之在黏連蛋白復(fù)合體中滑動，當遇到另一個方向相對的CTCF蛋白時會將染色質(zhì)固定為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。染色質(zhì)通過高度有序的多層級空間結(jié)構(gòu)，限制順式作用元件的相互作用，輔助基因表達調(diào)控。

不可或缺的計算方法

采用Hi-C技術(shù)獲取的數(shù)據(jù)量很大，一個樣本可達到百GB級。為了通過Hi-C數(shù)據(jù)探究染色質(zhì)的多層級結(jié)構(gòu)，高效精確的計算方法不可或缺。另外，Hi-C技術(shù)仍存在分辨率不夠、公共數(shù)據(jù)積累有限等局限性，相應(yīng)計算工具的開發(fā)則對這些不足進行了彌補。

基于Hi-C數(shù)據(jù)的染色質(zhì)多層級結(jié)構(gòu)分析方法

Hi-C數(shù)據(jù)可通過HiC-Pro、HiCExplore等軟件工具進行預(yù)處理，經(jīng)過序列比對、數(shù)據(jù)過濾、圖譜構(gòu)建、數(shù)據(jù)質(zhì)控等過程，預(yù)處理后的Hi-C數(shù)據(jù)可以用于染色質(zhì)區(qū)室、拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域和染色質(zhì)環(huán)等結(jié)構(gòu)的識別。目前已有多種計算工具可基于Hi-C數(shù)據(jù)對染色質(zhì)的各層級結(jié)構(gòu)進行識別分析，例如識別區(qū)室結(jié)構(gòu)的CscoreTools、SNIPER；識別拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域的Arrowhead、Insulation Score、Directionality index、TADbit、OnTAD、MrTADFinder；識別環(huán)結(jié)構(gòu)的HiCCUPS、Juicer、Fit-Hi-C等。這些工具的開發(fā)使得研究人員可以探尋不同物種基因組的三維結(jié)構(gòu)、機體不同發(fā)育階段染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律以及疾病狀態(tài)下的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變異。

基于序列及表觀遺傳數(shù)據(jù)的預(yù)測方法

DNA序列特征及表觀遺傳修飾與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成和變化密切相關(guān)，目前已有多個數(shù)據(jù)庫提供了豐富的組織和細胞的序列及表觀基因組信息，且有多種計算工具嘗試通過序列和表觀遺傳數(shù)據(jù)預(yù)測染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。筆者團隊近期對48種基于DNA序列及表觀遺傳信息進行染色質(zhì)相互作用及高級結(jié)構(gòu)預(yù)測的計算方法進行了總結(jié)、分類及性能比較，并對這些方法在不同生物領(lǐng)域中的應(yīng)用進行了總結(jié)[4]。其中包括預(yù)測染色質(zhì)環(huán)的CISD-loop、CTCF-MP、Lollipop和DeepMILO，預(yù)測拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域的CITD、PGSA、TAD-Lactuca、nTDP和BART，預(yù)測染色質(zhì)多聚模型的MiChroM、HiP-HoP、Chromatin states-based model，以及預(yù)測Hi-C相互作用圖譜的Rambutan、Akita和DeepC。這些工具可用于Hi-C數(shù)據(jù)缺乏時染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

基于深度學(xué)習(xí)提升Hi-C數(shù)據(jù)的分辨率

Hi-C數(shù)據(jù)的分辨率直接影響染色質(zhì)相互作用識別的有效性和準確性，目前大多數(shù)組織和細胞系仍缺乏高分辨率的Hi-C數(shù)據(jù)，通過大幅增加測序深度來獲取它們成本仍然較高，且隨著測序深度增加，指數(shù)增長的數(shù)據(jù)也給計算分析帶來了新的挑戰(zhàn)。筆者團隊開發(fā)的DeepHiC通過生成對抗網(wǎng)絡(luò)，提升Hi-C數(shù)據(jù)的分辨率，可以對染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)進行更加精準地預(yù)測[5]。DeepHiC提供了網(wǎng)絡(luò)運行界面（http：//sysomics.com/ deephic），用戶可以通過網(wǎng)頁提交數(shù)據(jù)，設(shè)定參數(shù)，計算后得到提升后的Hi-C數(shù)據(jù)[5]。

染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與發(fā)育

細胞分化不同階段的基因組三維結(jié)構(gòu)會發(fā)生動態(tài)變化，以此調(diào)控相關(guān)基因的表達，確保細胞可以正常發(fā)育并分化成特定的組織器官。研究表明，染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)在早期胚胎發(fā)育中具有重要作用，并與機體衰老密切相關(guān)。此外，在機體生長發(fā)育過程中，如果染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，會影響細胞的正常分化，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與早期胚胎發(fā)育

哺乳動物的染色質(zhì)多層級結(jié)構(gòu)在早期胚胎發(fā)育過程中逐漸建立，并發(fā)生動態(tài)重排，從而調(diào)控DNA復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、X染色體失活等過程。染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)塑造了胚胎發(fā)育過程中基因表達的調(diào)控密碼，調(diào)控細胞分化和命運決定。研究者們曾揭示了哺乳動物成熟精子和卵子的染色體3D結(jié)構(gòu)及早期胚胎發(fā)育過程中染色體結(jié)構(gòu)的重編程變化，為深入了解哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程打下了重要基礎(chǔ)。他們還揭示了人類早期胚胎中的染色體三維結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，并發(fā)現(xiàn)CTCF蛋白對于早期胚胎發(fā)育中拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)具有重要的調(diào)控功能，為進一步揭示人類胚胎發(fā)育機制提供了理論基礎(chǔ)。此外，還有研究人員發(fā)現(xiàn)染色體的三維結(jié)構(gòu)在受精后首先呈現(xiàn)出一種極其松散的狀態(tài)，并在隨后的胚胎早期發(fā)育過程中逐步地以親本特異的方式建立和成熟。他們與其他團隊合作通過體細胞核移植技術(shù)，發(fā)現(xiàn)核移植胚胎發(fā)育過程伴隨著劇烈的染色體高級結(jié)構(gòu)的重編程，黏連蛋白具有形成拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域和抑制minor ZGA基因的雙重功能，為研究早期胚胎發(fā)育過程中獨特的染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的形成機制和功能提供了重要線索。

染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與機體發(fā)育

染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)參與機體發(fā)育過程中的細胞譜系分化，維持機體的正常發(fā)育。染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)改變會影響基因調(diào)控，導(dǎo)致機體發(fā)育障礙。已有研究發(fā)現(xiàn)，拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域內(nèi)IHH基因座增強子的復(fù)制，會導(dǎo)致該基因表達發(fā)生組織特異性失調(diào)，與多趾癥的發(fā)生相關(guān)。而SOX9基因座的拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域邊界復(fù)制異常，會導(dǎo)致新拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域的形成，與烹調(diào)綜合征和短指等疾病相關(guān)。此外，先天性肢體畸形、自身免疫性疾病和性反轉(zhuǎn)等發(fā)育相關(guān)疾病也被證實與染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)失調(diào)相關(guān)。近日，筆者與其他團隊合作，開發(fā)了開放染色質(zhì)致密度算法SDOC來表征染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，基于SDOC對T細胞分化過程的研究發(fā)現(xiàn)，在T細胞分化過程中，如果拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，會抑制其他譜系基因的表達，表明染色質(zhì)結(jié)構(gòu)參與細胞分化和命運的調(diào)控[6]。

染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與衰老

染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)在機體衰老進程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究人員結(jié)合多能干細胞定向分化技術(shù)、基因組靶向編輯技術(shù)，以及表觀遺傳組分析技術(shù)揭示了異染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)失序是人類干細胞衰老的驅(qū)動力之一，為延緩和防治衰老相關(guān)疾病提供了新的潛在靶點和思路。

染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與癌癥

癌癥是一種致死率極高的惡性疾病。在正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞的多階段轉(zhuǎn)化過程中，基因組常發(fā)生各種突變，如點突變、小片段的插入和缺失、染色質(zhì)拷貝數(shù)變異和重排等。這些突變可能會造成基因組三維結(jié)構(gòu)變異，如染色質(zhì)區(qū)室轉(zhuǎn)換、拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域及染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)改變等，這些變異可能會導(dǎo)致原癌基因或抑癌基因表達異常，使細胞表現(xiàn)出永生化等惡性特征[7]。隨著有關(guān)癌癥與染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變異關(guān)系研究的深入，以染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)為靶點的癌癥治療策略逐漸成為研究熱點。

染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)變異與癌癥

近日，有實驗室整合分析了結(jié)腸癌和正常結(jié)腸的高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）及表觀遺傳數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中基因組區(qū)室發(fā)生了廣泛重組，A區(qū)室和B 區(qū)室之間存在重組的中間區(qū)室。在正常細胞中，中間區(qū)室更趨近于A區(qū)室，而在癌細胞中，中間區(qū)室普遍處于低甲基化狀態(tài)，更趨近于B區(qū)室 。通過結(jié)直腸腫瘤隊列的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，區(qū)室變化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄特征可以用于預(yù)測患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)移。

染色質(zhì)拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域作為染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的基本單位，其結(jié)構(gòu)變異會導(dǎo)致染色質(zhì)相互作用的改變，從而促使新的調(diào)控元件和基因接近，影響基因表達，參與細胞惡化過程。筆者團隊對骨髓瘤細胞與正常B細胞的高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)數(shù)據(jù)、全基因組測序數(shù)據(jù)及RNA-seq數(shù)據(jù)進行整合分析發(fā)現(xiàn)，與正常細胞相比，骨髓瘤細胞中拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量增加，平均長度減小。基因組中的染色質(zhì)拷貝數(shù)變異斷點經(jīng)常分布在拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域的邊界，提示拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域邊界的拷貝數(shù)變異位點更容易發(fā)生DNA鏈斷裂或被癌細胞克隆選擇[8]。此外，還有研究團隊通過T 細胞急性淋巴細胞白血病（T cell acute lymphoblastic leukemia， T-ALL）的研究發(fā)現(xiàn)，T-ALL中染色質(zhì)拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)變異，導(dǎo)致T-ALL重要致病基因MYC的異常表達。

此外，還有研究團隊發(fā)現(xiàn)了脈絡(luò)膜黑色素瘤特異性染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)，使神經(jīng)降壓素基因的啟動子區(qū)域與上游800 kb處的增強子相互作用，導(dǎo)致神經(jīng)降壓素的異常高表達，促進了脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的增殖和遷移。

基于三維基因組的癌癥治療

隨著Hi-C及其衍生技術(shù)的逐步成熟，染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與疾病的關(guān)系逐漸被發(fā)現(xiàn)，三維基因組也成為了抗癌治療的潛在靶標。筆者團隊整合了公共Hi-C數(shù)據(jù)和染色質(zhì)免疫共沉淀測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建了評價疾病相關(guān)染色體重排對基因組三維結(jié)構(gòu)影響的統(tǒng)計學(xué)方法，篩選出潛在由于三維結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致疾病發(fā)生的染色體重排數(shù)據(jù)，并開發(fā)了3Disease Browser網(wǎng)站（http：//3dgb. cbi.pku.edu.cn/disease/）用于集成和可視化疾病相關(guān)染色體重排與鄰近的染色體三維結(jié)構(gòu)[9]。另外，筆者團隊還結(jié)合三維基因組、千人基因組項目、表觀遺傳修飾和基因組序列特征，建立非編碼變異與其相互作用靶基因之間關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)站3DSNP（http：//www. cbportal.org/3dsnp/）[10]。

近年來，以染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)為靶標的抗癌療法逐漸被開發(fā)。有實驗室開發(fā)了一種癌癥治療策略——染色質(zhì)保護療法，從染色質(zhì)整體構(gòu)象出發(fā)，通過改變?nèi)旧|(zhì)的包裝密度，阻止癌癥的適應(yīng)性。在使用具有改變?nèi)旧|(zhì)包裝密度作用的塞來昔布和地高辛兩種藥物聯(lián)合化學(xué)藥物處理癌細胞后，研究人員發(fā)現(xiàn)癌細胞在兩三天幾乎被全部殺死，表明通過藥物靶向染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的方法改變細胞適應(yīng)性，聯(lián)合現(xiàn)有癌癥療法能夠有效殺死癌細胞。另外，另一研究團隊基于Hi-C、RNA-seq和CTCF的ChIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了人類急性白血病中的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)變化，并證明靶向NOTCH1信號通路的γ-內(nèi)分泌酶抑制劑可以改變白血病中發(fā)現(xiàn)的特定染色質(zhì)3D相互作用。

染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)結(jié)合相關(guān)計算工具的開發(fā)，極大地促進了對染色質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)及其在基因表達調(diào)控、細胞增殖分化、機體發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展中作用機制的理解。染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的研究將推動人們進一步探索染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)失調(diào)與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為癌癥等疾病的診療提供潛在靶點。

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關(guān)鍵詞：染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu) Hi-C 發(fā)育 疾病 ■