補(bǔ)氣活血通絡(luò)方對大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成及血紅素加氧酶-1基因表達(dá)的影響

俞云飛 胡鋼△ 蔡建平 嚴(yán)松鶴

骨折后由于創(chuàng)傷、手術(shù)等原因，容易出現(xiàn)多種并發(fā)癥，尤其是老年髖部骨折患者特殊的生理、病理改變，在創(chuàng)傷后多呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，容易形成深靜脈血栓(Deep Vein Thrombosis，DVT)及血栓相關(guān)性并發(fā)癥，對患者的療效及預(yù)后有著十分重要的影響[1]。因此，如何改善圍手術(shù)期血栓前狀態(tài)，避免DVT形成，是預(yù)防老年髖部骨折患者圍手術(shù)期并發(fā)癥的重要方法[2]。筆者前期研究表明[3]，應(yīng)用補(bǔ)氣活血通絡(luò)方可以有效改善氣虛血瘀型老年髖部骨折圍手術(shù)期血栓前狀態(tài)，預(yù)防DVT的形成，臨床療效明確，但其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究采用大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓模型，探究補(bǔ)氣活血通絡(luò)方改善血栓前狀態(tài)的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥改善血栓前狀態(tài)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6～8周齡SPF級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量(215.8±22.4)g，中位數(shù)215 g，動物均由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動物合格證號為SCXK(蘇)2017-007。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

補(bǔ)氣活血通絡(luò)方：黃芪 30 g、當(dāng)歸 6 g、赤芍5 g、地龍3 g、川芎3 g、桃仁3 g、紅花3 g、黨參10 g、白術(shù) 10 g等組成。中藥由無錫市中醫(yī)醫(yī)院中藥藥房配制，臨床使用劑量為每日1劑、雙煎袋裝，每袋150 mL，共2袋300 mL，分早晚2次服用。取1劑經(jīng)煎煮、過濾、濃縮成生藥含量為0.75 g/mL濃縮液，4 ℃保存?zhèn)溆?。水合氯?上海山浦化工有限公司，中國)，Bouin氏液(金克隆生物技術(shù)有限公司，中國)，實(shí)時PCR試劑盒(TOYOBO，中國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)時PCR試劑盒(TOYOBO，中國)；實(shí)時PCR儀(RocheLightCycler480，德國)；PCR反應(yīng)體系和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，美國)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和ECL發(fā)光液(上海碧云天公司，中國)。高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司，中國)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國)；石蠟切片機(jī)(Leica 公司，德國)；顯微鏡拍照系統(tǒng)(奧林巴斯公司，日本)；pH 儀(Orion model 公司，美國)。

1.4 方法

1.4.1造模方法[4]采用鉗夾大鼠單側(cè)股靜脈聯(lián)合髖部人字石膏固定，建立創(chuàng)傷性深靜脈血栓模型。大鼠稱重后腹腔注射5%水合氯醛(5 mL/kg)，麻醉、消毒、鋪巾，取腹股溝內(nèi)側(cè)縱行切口，分離、顯露并游離股靜脈血管，用蚊式鉗持續(xù)鉗緊股靜脈血管約3 s，單側(cè)股靜脈分別處理鄰近3個部位后縫合切口，術(shù)后行同側(cè)髖人字石膏固定，并給予正常飲食。

1.4.2分組方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將36只雄性SD大鼠分為造模組、低濃度中藥組、高濃度中藥組和阿司匹林組，每組9只。

1.4.3干預(yù)方法 造模組：采用鉗夾大鼠單側(cè)股靜脈聯(lián)合髖部人字石膏固定，建立創(chuàng)傷性深靜脈血栓模型，造模24 h后給予等量生理鹽水灌服。低濃度中藥組：造模24 h后依據(jù)《藥理試驗(yàn)中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》計算實(shí)際大鼠灌藥劑量，進(jìn)行2次/d(1.5 g/d)、持續(xù)3 d的中藥灌服。高濃度中藥組：造模24 h后依次進(jìn)行2次/d(3.0 g/d)、持續(xù)3 d的中藥灌服。阿司匹林組(陽性對照組)：將阿司匹林腸溶片碾碎、溶解后，于造模24 h后給予灌服，進(jìn)行2次/d(200 mg/kg)、持續(xù)3 d的阿司匹林溶液灌服。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，術(shù)前12 h禁食，術(shù)后不限飲食、飲水。

1.4.4標(biāo)本制作方法 造模并予藥物干預(yù)后當(dāng)天使用5%水合氯醛麻醉后，切開、顯露并剝離股靜脈血管，截取大鼠造模側(cè)4.0～5.0 cm股靜脈血管。每條股靜脈血管切取0.5～1.0 cm，用甲醛固定保存，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色組織切片病理學(xué)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)動物，并按江蘇省動物管理委員會條例進(jìn)行終末處理。

靜脈血栓HE染色：股靜脈標(biāo)本使用波恩氏(Bouin)固定液固定、石蠟包埋，切片，厚約5 μm。經(jīng)過、脫水、脫蠟后使用蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分化、1%氨水返藍(lán)、1%伊紅染色，酒精脫水，封片。

1.5 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測定

1.5.1血栓檢測 干預(yù)結(jié)束后當(dāng)天使用5%水合氯醛麻醉后，切開、顯露并剝離股靜脈血管，縱向剪開靜脈管腔，使用濾紙吸取該段血管內(nèi)血液，肉眼下觀察血栓形成情況及形態(tài)。小心取出血栓后即刻稱重為濕重，再用濾紙吸取表面血液后，置于60 ℃干燥箱內(nèi)2 h，冷卻后稱重為干重。

1.5.2Hmox-1基因mRNA表達(dá) 使用靜脈采血針采取大鼠心臟部位血液，每只大鼠2～3 mL。經(jīng)靜置、離心、去上清后，使用Trizol一步法提取沉淀細(xì)胞的總RNA。檢索設(shè)計Hmox-1引物序列(見表1)，合成反轉(zhuǎn)cDNA并反復(fù)擴(kuò)增，再通過實(shí)時PCR檢測Hmox-1 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果使用2-△△Ct方法分析。

表1 實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)過程中有4只大鼠死亡：造模組中1只造模時麻醉穿刺至腸道中導(dǎo)致死亡，低濃度組中1只建模時麻醉深度過深導(dǎo)致死亡，高濃度組2只在建模過程中刺破股靜脈導(dǎo)致失血死亡，上述大鼠死亡均與造模操作熟練度有關(guān)，再次補(bǔ)充購買大鼠后補(bǔ)齊每組大鼠數(shù)量。造模組和低濃度中藥組大鼠患肢(左肢)腫脹，皮膚顏色暗紅，直視下可見血管內(nèi)明顯暗紅色條狀物，血栓條較長，質(zhì)地較韌；高濃度中藥組和阿司匹林組患肢無明顯腫脹，皮膚顏色紅潤，直視下可見血管內(nèi)透明度較高，血栓條較短，質(zhì)地較疏松(見圖1)。

圖1 各組中血栓大體形成情況

各組血栓干、濕重結(jié)果：與造模組相比，其他3組血栓質(zhì)量均呈現(xiàn)降低趨勢，其中低濃度中藥組雖有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高濃度中藥組和阿司匹林組均明顯降低，且阿司匹林組最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血栓質(zhì)量比較

2.2 各組股靜脈血管HE染色情況

顯微鏡(100倍)下可見造模組和低濃度中藥組中股靜脈管內(nèi)膜形態(tài)不規(guī)則、管腔擴(kuò)張，血管壁組織水腫、增厚，腔內(nèi)大量紅細(xì)胞聚集、血栓形成，顏色呈現(xiàn)明顯暗紅色；高濃度中藥組中股靜脈管內(nèi)膜形態(tài)不規(guī)則、管腔略擴(kuò)張，腔內(nèi)較多血栓形成，顏色呈現(xiàn)紅色，血管管壁組織疏松；阿司匹林組中股靜脈管內(nèi)膜形態(tài)相對規(guī)則、管腔略擴(kuò)張，腔內(nèi)較少血栓形成，顏色呈現(xiàn)紅色，血管壁組織疏松(見圖2)。

圖2 各組大鼠股靜脈血管HE染色情況(100×)

2.3 Hmox-1基因mRNA表達(dá)情況

與造模組相比，阿司匹林組中Hmox-1表達(dá)呈現(xiàn)增高趨勢(P<0.05)，但低濃度和高濃度中藥組中Hmox-1表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴性上調(diào)，且高于阿司匹林組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組Hmox-1 mRNA表達(dá)比較 (2-△△Ct)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為凡離經(jīng)之血不能及時排除或消散，停留于體內(nèi)或血行不暢，阻遏于經(jīng)脈之內(nèi)及瘀積于臟腑組織器官的均稱為瘀血，凡瘀血內(nèi)阻的病變均為血瘀證。老年人髖部骨折后，局部可出現(xiàn)腫脹、壓痛、瘀斑等癥狀，其骨折本身引起的出血屬于離經(jīng)之血；若本身就存在肝腎不足、氣血虧虛，加之骨折后出血、長期臥床，進(jìn)一步損傷氣血，“氣為血帥”，氣傷則運(yùn)行不暢，氣不暢則血行滯緩，瘀血痹阻脈絡(luò)，營血回流受阻，津液運(yùn)化失常，水津外溢，停之肌膚則腫。因此，健脾益氣、活血通絡(luò)法是防止血栓形成的主要治法。

目前臨床上深靜脈血栓的預(yù)防措施包括藥物預(yù)防和物理預(yù)防[5]，其中抗凝藥物有凝血酶抑制劑、間接凝血酶抑制劑、維生素K拮抗劑、Xa因子抑制劑以及中藥制劑等。阿司匹林腸溶片是臨床上應(yīng)用最為廣泛的抗血小板聚集藥物，主要通過抑制COX-1活性，阻礙前列腺素、TxA2合成，從而抑制血小板聚集；藥物口服經(jīng)胃腸道吸收后降解為水楊酸，從第1天開始逐步增加抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用，且抑制作用在第3天開始穩(wěn)定[6]，但長期服用往往導(dǎo)致消化道出血、牙齦出血等不良反應(yīng)?；钛鲋兴幵诜乐窝ㄋㄈ约膊》矫嬉嗳〉昧藵M意的療效，中藥可通過多途徑、多環(huán)節(jié)來防止血栓形成，且不良反應(yīng)少，顯示良好的研究開發(fā)前景[7]。本研究中使用的補(bǔ)氣活血通絡(luò)方采用健脾益氣、活血通絡(luò)的思路擬方而成，方中黃芪補(bǔ)氣行血，扶正消瘀，為君藥；當(dāng)歸尾活血和血，化瘀而不傷血，為臣藥；黨參、白術(shù)健脾益氣，助脾統(tǒng)血，川芎、赤芍、桃仁、紅花助當(dāng)歸尾活血祛瘀，地龍行散走竄、通經(jīng)活絡(luò)，均為佐藥。筆者前期研究及既往研究表明[3，8]，應(yīng)用補(bǔ)氣活血通絡(luò)方與低分子肝素鈣比較，觀察兩組患者血液流變、凝血指標(biāo)及下肢靜脈彩超檢查，得出該方可以改善老年髖部骨折圍手術(shù)期血栓前狀態(tài)，預(yù)防DVT的形成。雖然該方臨床療效確切，但其作用機(jī)制尚不明確，影響了該類方劑的應(yīng)用與推廣。因此，筆者設(shè)計實(shí)驗(yàn)探討補(bǔ)氣活血通絡(luò)方對大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成的影響，研究結(jié)果表明：與造模組相比，使用高濃度中藥方劑和阿司匹林灌服的大鼠患肢皮膚顏色相對紅潤，且靜脈管腔內(nèi)血栓形成更短、質(zhì)地更韌，但低濃度中藥組的大鼠患肢皮膚顏色較灰暗，且血栓形成的大小、質(zhì)量以及質(zhì)地與造模組無明顯差異。通過血管HE染色觀察，進(jìn)一步證實(shí)高濃度的補(bǔ)氣活血通絡(luò)方可以改善血管壁水腫及炎癥細(xì)胞浸潤情況，減少管腔內(nèi)實(shí)質(zhì)性血栓形成，提示高濃度補(bǔ)氣活血通絡(luò)方可以減少創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成，對深靜脈血栓形成具有改善作用。

為探究補(bǔ)氣活血通絡(luò)方改善血栓形成的具體作用機(jī)制，筆者通過文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，深靜脈血栓形成主要與血管內(nèi)皮損傷后出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷后導(dǎo)致一系列連鎖炎癥反應(yīng)并釋放大量炎癥因素，改變局部與全身炎癥反應(yīng)情況，進(jìn)一步激活凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致局部血栓形成[9-10]。血紅素加氧酶是血紅素氧化分解的限制酶[11]，具有3種亞型，包括Hmox-1、Hmox-2、Hmox-3，其中Hmox-1也是熱休克蛋白中的一種，可在多種刺激因素作用下高表達(dá)于血液、肌肉、腦等組織，可以幫助內(nèi)皮細(xì)胞避免細(xì)胞凋亡，也可以通過調(diào)節(jié)血管緊張系統(tǒng)，減輕血管過度緊張與炎癥反應(yīng)，是血栓形成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的重要因素[12-14]。而本研究結(jié)果表明，補(bǔ)氣活血通絡(luò)方可以減輕大鼠深靜脈創(chuàng)傷性損傷后肢體腫脹及血栓形成程度。在此基礎(chǔ)上，筆者檢測各組大鼠心臟血液中Hmox-1基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，低濃度和高濃度中藥組中Hmox-1基因表達(dá)明顯高于造模組，且呈現(xiàn)濃度依賴性增高，而阿司匹林組中Hmox-1基因表達(dá)相對較低，提示補(bǔ)氣活血通絡(luò)方可能是通過上調(diào)Hmox-1基因表達(dá)抑制創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成，但具體通過何種途徑調(diào)節(jié)Hmox-1基因尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，補(bǔ)氣活血通絡(luò)方可以抑制大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成，該作用可能與誘導(dǎo)Hmox-1基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)，為中醫(yī)藥治療創(chuàng)傷性血栓性疾病提供一定理論依據(jù)和可能的研究方向。本研究僅初步探討其可能的作用機(jī)制，對Hmox-1基因具體調(diào)節(jié)途徑及與炎癥反應(yīng)的相互作用還有待進(jìn)一步探究。