亨廷頓氏病的神經(jīng)興奮和線粒體毒性發(fā)病機(jī)理與動(dòng)物模型

唐文潔,黃艷,王力峰,魏佑震*,謝元云*

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心,教育部心律失常重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200120;2.山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院康復(fù)科,濟(jì)南 250022;3.贛南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院國(guó)家老年病臨床研究中心,江西 贛州 341000)

亨廷頓氏病(Huntington’s disease,HD)是一種常染色體顯性遺傳神經(jīng)退行性疾病,主要臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)、智力、心理功能障礙[1]。其主要的病理變化表現(xiàn)在大腦基底核的紋狀體,以紋狀體傳出型棘狀神經(jīng)元的大量缺失為著,可以累積更廣泛腦區(qū)甚至皮質(zhì)。紋狀體屬于錐體外系,當(dāng)大量神經(jīng)元丟失時(shí),肢體運(yùn)動(dòng)功能受限,出現(xiàn)癥狀。流行病學(xué)調(diào)查表明,全世界HD的平均發(fā)病率為5/100 000~8/100 000,以歐美洲和非洲裔發(fā)病率最高,呈逐年增高趨勢(shì)。美國(guó)HD的發(fā)病率為4.1/100 000~8.4/100 000,美國(guó)現(xiàn)有約3萬HD患者,其HD基因攜帶者(自身或后代可能發(fā)病)有15萬人。亞洲尤其東亞裔HD發(fā)病率較低,發(fā)病率約為0.42/100 000,說明HD發(fā)病有種族差異[2-3]。HD是致命的,最常見HD的發(fā)病年齡為30歲~40歲[4],患者發(fā)病后存活時(shí)間約10年~15年,發(fā)病后期患者生活不能自理,給家庭和社會(huì)帶來巨大護(hù)理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。至今臨床上對(duì)HD尚無有效的治療或預(yù)防措施,針對(duì)各種HD癥狀的藥物和控制措施效果不理想,甚至由于藥物毒副作用太大而不得不終止治療。為更全面認(rèn)識(shí)HD發(fā)病機(jī)理、研究興奮性神經(jīng)毒性和線粒體能量代謝異常所致的腦組織及神經(jīng)元損傷分子機(jī)制,研發(fā)相應(yīng)的治療性藥物及方案,了解并掌控相應(yīng)的動(dòng)物模型十分重要。本文綜述介紹以HD組織病理學(xué)及生物化學(xué)為發(fā)病機(jī)制而建立的HD動(dòng)物模型,即興奮性神經(jīng)毒性模型和線粒體毒素模型。

1 興奮性神經(jīng)毒素喹啉酸(quinolinic acid,QA)誘導(dǎo)的HD動(dòng)物模型(QA模型)

1.1 造模機(jī)制

QA興奮性神經(jīng)毒性機(jī)制研究得比較清楚[5-11](圖1),QA是體內(nèi)犬尿氨酸(Kynurenine)代謝產(chǎn)物之一。通過食物被攝入的色氨酸(tryptophan)在體內(nèi)一些中性氨基酸載體的協(xié)助下,通過血腦屏障抵達(dá)腦組織,被腦組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等吸收,經(jīng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸雙加氧化酶(tryptophan dioxygenase)催化轉(zhuǎn)化成犬尿氨酸,后者在羥基黃烷酸酶(3-hydroxyanthranitic acid)催化下分解成QA和其它代謝產(chǎn)物。正常生理代謝水平的QA并不會(huì)造成細(xì)胞毒性;然而超出生理水平,即便少量增高的QA將引起細(xì)胞毒性和死亡。Tatter等[12]的研究發(fā)現(xiàn)QA可以增加動(dòng)物紋狀體變異亨廷頓蛋白(mutant Huntingtin,mHTT)水平,而正常亨廷頓蛋白對(duì)QA引起的細(xì)胞損傷有保護(hù)作用[13]。這些研究結(jié)果支持異常腦內(nèi)QA水平增高與HD的相關(guān)性。

圖1 QA興奮性毒性機(jī)制示意圖Figure 1 Schematic diagram of QA excitotoxicity mechanism

研究發(fā)現(xiàn)HD在包括基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)降解等方面顯示細(xì)胞功能異常[14-15]。但在此之前,興奮性毒性的HD發(fā)病機(jī)制,即通過谷氨酸受體過量信號(hào)傳導(dǎo)引起的神經(jīng)損傷,得到了大量研究結(jié)果支持。首先提出興奮性神經(jīng)毒性在HD發(fā)病機(jī)制中的作用,是通過對(duì)嚙齒類動(dòng)物紋狀體內(nèi),注射兩種犬尿氨酸內(nèi)源性代謝產(chǎn)物QA或紅藻氨酸(kainic acid,KA),可以誘導(dǎo)許多類似HD樣神經(jīng)化學(xué)和組織病理學(xué)特征[16-20]以及HD樣的行為缺陷[21-23]。后來通過研究更多HD患者和動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn):興奮性傳導(dǎo)通路NMDA和mGluR5受體信號(hào)傳導(dǎo)異常,以及線粒體膜鈣離子通道激活和鈣內(nèi)流失調(diào)。因此,HD是mHTT引起的多因素導(dǎo)致興奮性谷氨酸受體活性增高和鈣信號(hào)傳導(dǎo)失衡所致[24-25]。

興奮性神經(jīng)毒性作為HD關(guān)鍵致病因素的進(jìn)一步證據(jù),來自于檢測(cè)犬尿氨酸內(nèi)源性的代謝途徑產(chǎn)物。N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體激動(dòng)劑QA在YAC128小鼠紋狀體和大腦皮質(zhì)明顯增加。此外,另外一種犬尿氨酸代謝產(chǎn)物3-羥基犬尿氨酸(3-HK),已知可增強(qiáng)QA介導(dǎo)的興奮性毒性,也在YAC128小鼠的大腦皮層和紋狀體升高[26]。在早期HD患者大腦皮質(zhì)和新紋狀體也發(fā)現(xiàn)類似的QA和3-HK含量升高[27];并且這種增高的量和疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[28-29]。QA和3-HK在介導(dǎo)興奮性神經(jīng)毒性方面作用以及HD患者和YAC128小鼠腦組織內(nèi)源性代謝水平增高,支持HD興奮性神經(jīng)毒性的發(fā)病機(jī)制。

1.2 造模方法

1.2.1 嚙齒類動(dòng)物大(小)鼠腦紋狀體(尾狀核)內(nèi)注射QA模型

大鼠QA造模方法[30]如下:體重180~200 g的Wistar大鼠,經(jīng)腹腔注射硫噴妥鈉30 mg/kg誘導(dǎo)麻醉。大鼠對(duì)趾壓刺激失去反應(yīng)并呼吸和心跳平穩(wěn)后,頭顱立體定位:將頭部俯臥固定于立體定位儀上,調(diào)整定位儀左右耳桿和齒桿高度,使大鼠頭頂部位水平。麻醉后動(dòng)物腹部放置加熱墊以維持動(dòng)物正常體溫?cái)z氏37℃左右,再給動(dòng)物眼球涂干凈潤(rùn)滑劑以確保眼球濕潤(rùn)和保護(hù)眼角膜。將手術(shù)部位(約1 cm2)毛發(fā)剃凈,先涂碘伏后涂70%乙醇,共3次,然后皮下注射布比卡因50μL局部麻醉。

用手術(shù)刀沿頭頂正中線切開皮膚,盡量往外側(cè)分開以暴露頂顱骨。確認(rèn)Bregma以及顱頂前后左右側(cè)在同一水平高度。從前至Bregma-0.6 mm,從外側(cè)至Bregma 2.6 mm,從硬脊膜至腹側(cè)深4.5 mm。用醫(yī)用牙鉆在注射點(diǎn)顱骨鉆小孔后,用2μL Hamilton微量注射針(30 Gauge)將0.5μL 300 mmol/L QA生理鹽水(pH=7.4)于4 min內(nèi)緩慢注射完。1 min后,小心緩慢地將注射針提升移開。確保沒有活動(dòng)性出血后,縫合手術(shù)切口,用生理鹽水清洗創(chuàng)面,皮下注射叔丁啡止痛,將動(dòng)物轉(zhuǎn)移到蘇醒處繼續(xù)保溫觀察,直到動(dòng)物術(shù)后麻醉完全蘇醒恢復(fù)活動(dòng)后,歸鼠籠正常飼養(yǎng)。

小鼠QA造模方法和大鼠QA造?；鞠嗤琜31]。選用體重25~30 g的成年小鼠,包括C57BL/6、C57BL/10和FVB/N等不同種系小鼠,并且使用小鼠立體定位儀按成年小鼠大腦立體定位注射參數(shù),即從前至Bregma 0.3 mm,從外側(cè)至Bregma 1 mm,從頭頂部至腹部深2.5 mm,給藥劑量體重比同大鼠。

1.2.2 非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(狨猴)腦內(nèi)注射QA模型

QA造模方法[32]為:2~3歲狨猴,雌雄皆可,先經(jīng)腹腔注射氯胺酮0.05 mL(Vetalar,Parke Drive Veterinary),然后使用Saffan(安泰酮:成分二羥孕烷二酮和羥-5α-孕烷二酮)(0.1 mL/100 g,Pitman-Moore,UK)誘導(dǎo)麻醉。觀察動(dòng)物麻醉至手術(shù)水平,呼吸和心跳平穩(wěn)后,將其頭部俯臥固定于猴腦立體定位儀上,調(diào)整定位儀左右耳桿和齒桿高度,使頭頂部位水平。其余與大鼠準(zhǔn)備相同。

霧化吸入治療過程中,確?；純翰扇∽换蛘甙胱P位,使膈肌下移,便于霧化吸入后肺部充分?jǐn)U展,增加氣體的交換量。

用手術(shù)刀沿頭頂正中線切開皮膚,往兩側(cè)分開以暴露頭頂顱骨。確認(rèn)Bregma以及顱頂前后左右側(cè)在同一水平高度。按Bregma位置用立體定位儀分別標(biāo)定尾狀核和殼核注射點(diǎn)位置,立體定位注射點(diǎn)位置參數(shù)可參考Kendall等[32]的方法。在注射點(diǎn)顱骨鉆小孔后,用2μL Hamilton微量注射針(30 Gauge)將0.15~0.25μL 0.1 mol/L QA生理鹽水(pH=7.4)按0.1μL/min速度緩慢注射完。留針1 min后,小心緩慢地將注射針提升移開。確保沒有活動(dòng)出血后,縫合手術(shù)切口,生理鹽水清洗創(chuàng)面,皮下注射安定(Valium,Roche,5 mg/mL)0.05~0.2 mL,以控制手術(shù)后抽搐,將動(dòng)物轉(zhuǎn)移到避光處,直到動(dòng)物術(shù)后麻醉完全蘇醒,恢復(fù)活動(dòng)后,回歸籠養(yǎng)。

1.3 模型評(píng)估主要指標(biāo)

1.3.1 興奮性毒性造成的行為學(xué)改變

由于QA的急性興奮性神經(jīng)毒性作用,通常動(dòng)物被注射QA麻醉蘇醒后,立刻呈現(xiàn)神經(jīng)損傷癥狀。單側(cè)紋狀體注射QA,動(dòng)物將出現(xiàn)躁狂、跳躍、步態(tài)不穩(wěn)及不對(duì)稱的單向循轉(zhuǎn)或跑動(dòng)等。這種非對(duì)稱性運(yùn)動(dòng)是單側(cè)紋狀體受損引起多巴胺信號(hào)傳導(dǎo)通路左右不平衡所致。QA誘導(dǎo)的這種異?；钴S不穩(wěn)定行為和HD患者早期運(yùn)動(dòng)功能障礙相似。術(shù)后0.5~1 h內(nèi),這種異常的行為將緩慢地減少,動(dòng)物逐漸趨于穩(wěn)定,并且出現(xiàn)明顯活動(dòng)減少,和HD晚期患者癥狀相似。Morris水迷宮、放射臂水迷宮、T型水迷宮等測(cè)試結(jié)果表明QA神經(jīng)毒性損傷了動(dòng)物的認(rèn)知功能。這些行為測(cè)試評(píng)估的動(dòng)物工作和參考記憶,需要皮質(zhì)紋狀體通路的參與才能完成[22,24-25,33]。Rotarod平衡運(yùn)動(dòng)測(cè)試也經(jīng)常用于檢測(cè)受損傷動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)功能,和對(duì)照組相比,QA損傷動(dòng)物在Rotarod轉(zhuǎn)軸上掉落次數(shù)增加和停留時(shí)間減少,表明QA損傷了動(dòng)物的學(xué)習(xí)和運(yùn)動(dòng)技能。被動(dòng)游泳實(shí)驗(yàn)用以觀察動(dòng)物在一個(gè)玻璃圓柱體內(nèi)游泳行為,紋狀體受傷動(dòng)物在水面漂浮不動(dòng)時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照動(dòng)物,說明QA損傷導(dǎo)致動(dòng)物降低了求生欲望。

1.3.2 興奮性毒性造成的神經(jīng)組織損傷

紋狀體注射QA后7 d左右,動(dòng)物麻醉后經(jīng)心灌注4%多聚甲醛,取腦,30%蔗糖PB浸透,恒冷切片,25~30μm,FLUORO-JADE?C組織化學(xué)染色。和對(duì)照動(dòng)物相比,QA引起動(dòng)物受損紋狀體組織顯著綠色熒光顯色(圖2)。QA興奮性神經(jīng)毒性引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡,包括細(xì)胞壞死和凋亡,與HD神經(jīng)細(xì)胞死亡機(jī)制相似[17]。QA損傷導(dǎo)致與HD患者腦組織相似的選擇性神經(jīng)損傷和病理改變,比如GABAergic,腦啡肽和P物質(zhì)免疫染色陽性神經(jīng)元顯著減少,這與青少年發(fā)病HD的腦神經(jīng)元丟失相似;相反,有些神經(jīng)元比如膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶免疫陽性染色神經(jīng)元?jiǎng)t相對(duì)不受影響[34]。

圖2 紋狀體FLUORO-JADE?C組織化學(xué)染色Note.A.Group QA.B.Control group.Figure 2 FLUORO-JADE? C HistochemicalStaining of Striatum

1.4 模型特點(diǎn)

QA通不過血腦屏障,因此QA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性模型必須腦內(nèi)給藥,一般是通過腦立體定位手術(shù)在紋狀體給藥。盡管如此,建立本模型的手術(shù)步驟比較簡(jiǎn)單,一般實(shí)驗(yàn)室條件下可以完成。該模型重復(fù)性較好,穩(wěn)定性和可靠性高。QA是一種常用而且容易取得的化學(xué)試劑,經(jīng)濟(jì)適用;可應(yīng)用于多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,包括嚙齒類大小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物比如猴等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和目的不同,QA可以注射到單側(cè)或雙側(cè)紋狀體,也可以注射不同QA的量,以控制損傷的范圍和嚴(yán)重程度,操作靈活。最后,該模型的檢測(cè)和評(píng)估也比較簡(jiǎn)單,可以進(jìn)行組織病理學(xué)和行為學(xué)檢測(cè)等。

QA興奮性神經(jīng)毒性引起的神經(jīng)病理學(xué)和行為學(xué)改變都是急性的,這和HD的漸進(jìn)性和慢性發(fā)病不同;HD是一種遺傳性神經(jīng)退行性疾病,而QA興奮性神經(jīng)毒性引起的急性神經(jīng)損傷沒有任何遺傳和其它因素參與;與HD不同,QA不會(huì)誘導(dǎo)mHTT聚集體形成;HD病程長(zhǎng)以及發(fā)病早期和晚期臨床表現(xiàn)通常不同,這與QA興奮性神經(jīng)毒性導(dǎo)致紋狀體損傷后出現(xiàn)的癥狀也不同。這是在選擇這類動(dòng)物模型模擬HD時(shí)需要考慮的。

1.5 模型應(yīng)用

興奮性神經(jīng)毒性導(dǎo)致的腦神經(jīng)損傷,是最早提出的HD發(fā)病機(jī)制。QA模型已經(jīng)被廣泛研究和特別應(yīng)用于尋找HD的治療措施[35-36]。由于QA產(chǎn)生明顯和可以預(yù)測(cè)的神經(jīng)元死亡,QA模型經(jīng)常被用來檢測(cè)一些神經(jīng)保護(hù)作用的藥物和評(píng)估HD治療效果。Emerich等[37]利用雙側(cè)紋狀體注射QA的大鼠模型測(cè)試經(jīng)過基因改造的睫神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF),發(fā)現(xiàn)CNTF可以預(yù)防紋狀體的細(xì)胞丟失以及減少大腦皮質(zhì)萎縮等。通過QA模型,研究也發(fā)現(xiàn)其它幾種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子比如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF),可以保護(hù)HD動(dòng)物模型受損的紋狀體神經(jīng)元[38-40]。神經(jīng)元過興奮毒性損傷是神經(jīng)元跨突觸死亡的一種形式,QA引起神經(jīng)元損傷模型具有神經(jīng)元損傷及保護(hù)、修復(fù)研究的普適性。可以用于研究神經(jīng)元過興奮毒性損傷機(jī)制以及相應(yīng)神經(jīng)修復(fù)保護(hù)類藥物的研發(fā)[35-36,38-39]。

2 線粒體毒素3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NP)誘導(dǎo)的HD動(dòng)物模型(3-NP模型)

2.1 造模機(jī)制

基于線粒體功能受損和能量代謝紊亂學(xué)說,使用線粒體毒素誘導(dǎo)急性線粒體受損和能量代謝紊亂引起紋狀體病變[5,7-8,41-44],而建立HD模型(見圖3)。這類神經(jīng)毒素包括線粒體抑制劑,例如丙二酸和3-NP,造成靶向電子傳遞鏈的復(fù)合物降低ATP水平并導(dǎo)致細(xì)胞能量損耗[45-46]。降低的ATP水平,導(dǎo)致細(xì)胞和線粒體部分膜去極化,減弱電壓依賴性Mg2+阻斷NMDA受體,引起紋狀體NMDA受體依賴性的繼發(fā)興奮性毒性損傷[47-48]。這些線粒體毒素,已經(jīng)被廣泛用于嚙齒類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物以建立HD模型和相關(guān)研究[45,48-58]。

圖3 3-NP造模機(jī)制示意圖Figure 3 Schematic diagram of 3-NP producing animal models

HD患者大腦和周圍組織中線粒體功能缺陷,反映了mHTT可能對(duì)線粒體產(chǎn)生直接影響[69,72-73]。例如,mHTT可能改變線粒體膜形成的鈣離子通道,而直接影響線粒體鈣離子流通[69];或者,mHTT可能干擾線粒體裂變和融合過程中的細(xì)胞器功能,導(dǎo)致線粒體變性和功能障礙[74]。3-NP是一種引起嚙齒類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物神經(jīng)元化學(xué)改變的線粒體毒素,可以引起大腦皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體分裂和最終引起細(xì)胞死亡;但這種毒性作用可以被NMDA受體拮抗劑所阻斷,揭示HD能量代謝障礙是通過NMDA受體介導(dǎo)所致[46,56,75]。此外,表達(dá)mHTT的HeLa細(xì)胞在氧化應(yīng)激時(shí),線粒體受損裂解片段化增多;而抑制線粒體裂變或促進(jìn)線粒體的融合,卻可以防止mHTT導(dǎo)致的線粒體片段化和相關(guān)的細(xì)胞死亡[76]。

更多直接來自YAC轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的研究證明,mHTT對(duì)線粒體作用可以增強(qiáng)NMDA受體介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性。利用原代培養(yǎng)的YAC46小鼠的中棘神經(jīng)元,證明輔酶Q10可以抑制線粒體的環(huán)孢菌素A和bongkrekic acid(是一種由假單胞菌分泌的線粒體毒素,線粒體腺嘌呤核苷酸(ADP/ATP)轉(zhuǎn)位酶的特異性配體),從而減少線粒體膜滲透性和減少NMDA受體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡等神經(jīng)保護(hù)作用[77]。對(duì)YAC128小鼠的中型多棘神經(jīng)元研究也獲得了跟上述類似結(jié)果[78-79]。這些研究結(jié)果表明,線粒體功能受損和興奮性神經(jīng)毒性可能是mHTT誘發(fā)的HD早期發(fā)病的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制。

2.2 造模方法

2.2.1 紋狀體(尾狀核)局部注射3-NP的動(dòng)物模型

3月齡雄性SD大鼠,經(jīng)腹腔注射戊巴比妥50 mg/kg誘導(dǎo)麻醉。基礎(chǔ)準(zhǔn)備工作同前。

沿頭部正中線切開皮膚,暴露頭頂顱骨。確認(rèn)Bregma以及顱頂前后左右側(cè)在同一水平高度。按Bregma位置從前至Bregma-0.4 mm,從外側(cè)至Bregma 2.6 mm,從硬脊膜至腹側(cè)深4.5 mm。在注射點(diǎn)顱骨鉆小孔后,用Hamilton 10μL微量注射針(30 Gauge)將1μL 3-NP溶于水,按20 mg/(kg·mL)(pH 7.4)在1 min內(nèi)緩慢注射完[17,45]。后續(xù)工作同前。

2.2.2 腹膜腔注射3-NP的動(dòng)物模型

腹腔注射3-NP劑量遞增模型:雄性SD大鼠520~560 g,Lewis大鼠340~370 g,和Fisher大鼠270~300 g經(jīng)腹腔注射3-NP,首劑量7 mg/kg體重,然后逐日按15%增加劑量,至動(dòng)物死亡。Fisher大鼠對(duì)3-NP毒性耐受最差,動(dòng)物用藥3~4 d死亡,其次是SD大鼠,于用藥后10~11 d死亡,最耐受3-NP毒性的是Lewis大鼠,可以耐受藥物毒性15~16 d[80-81]。

腹膜腔注射3-NP恒量急性損傷模型:大鼠經(jīng)腹膜腔注射3-NP,劑量為20 mg/kg體重,連續(xù)4 d。

2.2.3 皮下注射3-NP的動(dòng)物模型

急性誘導(dǎo)模型:(1)濃度為80 mg/mL的3-NP溶于去離子水并用1 mmol/L NaOH將pH調(diào)整為7.4。Lewis大鼠皮下注射3-NP(20 mg/kg體重),每天8:00和17:00各1次,連續(xù)5 d。(2)通過氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉大鼠后,于皮下包埋滲透給藥泵(alzet osmotic pump)持續(xù)釋放給藥:每天3-NP劑量為20 mg/kg體重,溶度為20 mg/mL,連續(xù)5 d[45]。

慢性誘導(dǎo)模型:通過大鼠皮下包埋Alzet Osmotic Pump持續(xù)釋放3-NP,每天劑量為12 mg/kg體重,連續(xù)1個(gè)月[82]。

2.2.4 肌肉注射3-NP的動(dòng)物模型

濃度為150 mg/mL的3-NP溶解于去離子水并用1 mmol/L NaOH將其pH調(diào)整為7.4。預(yù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3-NP每天劑量為10 mg/kg體重,每天肌注2次,分別為8:00和17:00,1周后動(dòng)物出現(xiàn)明顯胃腸道副作用如嘔吐等,因此,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌注射劑量調(diào)整為每天5 mg/kg體重。1周后每天劑量在原劑量基礎(chǔ)上增加1 mg/kg體重,直至總劑量8 mg/kg體重,此后每天增加劑量改為0.5 mg/kg體重,至動(dòng)物出現(xiàn)明顯急性神經(jīng)損傷癥狀時(shí)停止用藥,比如動(dòng)物出現(xiàn)嘔吐嗜睡和疲乏癥狀,這些癥狀通常會(huì)持續(xù)約48 h;同時(shí)伴隨步態(tài)不穩(wěn)異常以及后肢活動(dòng)障礙和眼球活動(dòng)失調(diào)等。停藥3~5 d后,上述癥狀將會(huì)緩解[83]。

2.3 模型評(píng)估

3-NP可以特異性損傷線粒體琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)而影響能量代謝。Túnez等[81]研究了經(jīng)腹腔注射3-NP的大鼠模型,每天劑量為20 mg/kg體重,連續(xù)4 d,發(fā)現(xiàn)3-NP能夠顯著抑制琥珀酸脫氫酶活性,與對(duì)照組比,減少60%;同時(shí),3-NP明顯增加腦尤其是紋狀體神經(jīng)元的脂質(zhì)過氧化以及蛋白碳基化合物(protein carbonyls)水平和過氧化物歧化酶(superoxide dismutase)活性[81]。

Guyot等[84]觀察經(jīng)腹腔注射或皮下長(zhǎng)期給藥,與對(duì)照組比,3-NP可以選擇性地?fù)p傷紋狀體以及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞,引起神經(jīng)損傷包括膠質(zhì)反應(yīng)等,而大腦皮質(zhì)則相對(duì)不受其影響。Ouary等[80]發(fā)現(xiàn)3-NP這種對(duì)腦和神經(jīng)元選擇性損傷。大鼠注射3-NP 5 d后,動(dòng)物紋狀體神經(jīng)元細(xì)胞核可見DNA損傷以及細(xì)胞核裂解。焦油紫和Hoechst 33285組織化學(xué)染色以及TUNEL染色均證實(shí)紋狀體神經(jīng)元凋亡。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)Calbindin免疫陽性染色細(xì)胞減少,與紋狀體中型多棘神經(jīng)元丟失相吻合;而NADPH-diaphorase和ChAT陽性神經(jīng)元?jiǎng)t免受影響,顯示3-NP可以選擇性地?fù)p傷紋狀體神經(jīng)元[80]。

Palfi等[83]觀察了3-NP對(duì)狨猴紋狀體損傷引起的運(yùn)動(dòng)功能障礙。5~8歲的狨猴每天兩次肌注3-NP,劑量從5 mg/kg體重開始,然后劑量逐漸增加直至動(dòng)物出現(xiàn)明顯神經(jīng)損傷癥狀。3-NP的急性神經(jīng)損傷癥狀包括輕微不協(xié)調(diào)步態(tài)以及后肢運(yùn)動(dòng)障礙。此外,動(dòng)物動(dòng)眼神經(jīng)功能也出現(xiàn)異常,比如不能協(xié)調(diào)左右水平和上下垂直眼球運(yùn)動(dòng)。損傷2~4周后,動(dòng)物出現(xiàn)舞蹈樣動(dòng)作,以下肢為著,導(dǎo)致活動(dòng)不協(xié)調(diào),逐漸波及全身包括頭面部,由于肌肉控制失調(diào)出現(xiàn)怪異表情等[83]。

2.4 模型特點(diǎn)

由于3-NP可以通過血腦屏障,建立模型時(shí)給藥方便,可以采用經(jīng)腹腔、皮下或肌肉注射途徑。3-NP的藥物毒性會(huì)影響動(dòng)物體重,在建模過程中每天可以根據(jù)動(dòng)物實(shí)際體重及時(shí)調(diào)整藥物劑量。無論采用任何一種途徑給藥,模型建立的可靠性和重復(fù)性高。此外,還可以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求,采用大劑量誘導(dǎo)急性損傷或低劑量長(zhǎng)期給藥誘導(dǎo)損傷。3-NP模型導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷和HD線粒體功能紊亂引起的神經(jīng)病變,以及神經(jīng)功能障礙和HD有不少相似之處,所以該模型已經(jīng)被廣泛用于HD線粒體損傷機(jī)制和相關(guān)神經(jīng)保護(hù)治療的研究。盡管如此,3-NP誘導(dǎo)的線粒體損傷以及導(dǎo)致的神經(jīng)病理和功能改變,畢竟與HD由于基因突變經(jīng)過長(zhǎng)期慢性積累和體內(nèi)外環(huán)境因素參與的HD神經(jīng)病理變化,有著本質(zhì)不同。

2.5 模型應(yīng)用

HD線粒體功能和能量代謝障礙,使得3-NP模型特別適合于該線粒體損傷機(jī)制的研究,以及尋找針對(duì)線粒體受損保護(hù)的藥物和治療方案的研發(fā)[45,47-48,85]。Bachoud-Lévi等[86]發(fā)現(xiàn)CNTF可以改善3-NP誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)功能障礙。有研究表明GDNF可以保護(hù)3-NP引起的紋狀體受損神經(jīng)元,以及改善動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能[87]。兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)用Coenzyme Q10治療3-NP引起的線粒體損傷,發(fā)現(xiàn)可以重建部分受損的線粒體功能[88-89]。

3 結(jié)論

綜上,當(dāng)今最為廣泛應(yīng)用于HD病理機(jī)制和治療研究的是嚙齒類HD動(dòng)物模型。在眾多HD動(dòng)物模型中,可以根據(jù)研究目標(biāo)而選擇不同動(dòng)物模型。通過非遺傳機(jī)制建立的HD動(dòng)物模型主要有興奮性神經(jīng)毒性QA模型和線粒體毒素3-NP模型,這些動(dòng)物模型在幫助認(rèn)識(shí)亨廷頓氏病以及探尋HD的治療發(fā)揮了重要作用。由于篇幅所限,目前廣泛應(yīng)用的亨廷頓氏病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型沒有在本文介紹。