HPLC法測(cè)定太子參藥材中多糖水解產(chǎn)物單糖的含量

王慧娟 喬楊 張敏 彭禮軍

【摘 要】 目的：建立柱前衍生化-HPLC法測(cè)定太子參多糖中鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的含量。方法：分別對(duì)液相色譜條件、多糖水解和衍生化條件進(jìn)行優(yōu)化，比較不同條件下單糖衍生物的峰面積變化，確定太子參藥材中多糖水解產(chǎn)物單糖的含量測(cè)定方法。結(jié)果：在鹽酸（3 mol·L-1）110 ℃、30 min條件下水解太子參多糖，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化水解的單糖產(chǎn)物。液相色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-0.02 mol·L-1的乙酸銨溶液（19∶81，V/V）。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，鼠李糖、半乳糖和木糖的精密度、重復(fù)性及加樣回收率均符合要求。結(jié)論：該方法穩(wěn)定可靠，可用于太子參藥材中多糖水解產(chǎn)物單糖的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 太子參多糖;單糖;含量測(cè)定;柱前衍生化;高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）15-0036-07

Abstract：Objective To establish a pre-column derivatization HPLC method for the determination of rhamnose， glucose， galactose and xylose in polysaccharide from Radix Pseudostellariae. Method The HPLC， polysaccharide hydrolysis and monosaccharides derivatization conditions were optimized respectively. The determination method of monosaccharides was finally obtained through comparing the peak areas of monosaccharide derivatives under the different conditions. Result The polysaccharide was hydrolyzed 30 minutes to monosaccharides under the acidic condition of 3 mol·L-1 hydrochloric acid at 110 ℃， then the hydrolysate was derivatized with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone （PMP） and analyzed by HPLC. The separation was performed on an Agilent Eclipse XDB-C18 column and the mobile phase consisted of acetonitrile and 0.02 mol·L-1 ammonium acetate solution in the ratio of 19∶81（V/V ）. For rhamnose， galactose and xylose， the tests of precision， repeatability and recovery all meet the requirements of the methodology. Conclusion The method was stable and reliable， and it is suitable for the determination of monosaccharides in polysaccharide hydrolyzate from Radix Pseudostellariae.

Keywords：Polysaccharides From Radix Pseudostellariae;Monosaccharide;Content Determination; Pre-column Derivation;HPLC

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax ex Pax et Hoffm. 的干燥塊根，中醫(yī)臨床常用補(bǔ)益藥[1]。近年來，人們對(duì)太子參化學(xué)成分進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究[2]。研究[3-6]表明，多糖是太子參的重要活性成份，具有抗應(yīng)激、抗氧化和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用，對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷和大鼠急性心肌梗死誘發(fā)的心肺損傷有一定的保護(hù)作用。

太子參多糖主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖等組成[7]。本研究在此基礎(chǔ)上，建立柱前衍生化-HPLC法測(cè)定太子參多糖中鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的含量，為太子參藥材質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的完善提供基礎(chǔ)。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），F(xiàn)A2004型分析天平（上海良平儀器儀表有限公司），GZX-9146MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）。

太子參藥材（貴州百靈制藥有限公司）;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）;葡萄糖（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，含量≥98.0%）;半乳糖（solarbio公司，含量≥99.0%）;鼠李糖（上海源葉生物科技有限公司，含量≥98.0%）、木糖（上海源葉生物科技有限公司，含量≥99.0%）;醋酸銨、氯仿、氫氧化鈉、甲醇、濃鹽酸、三氟乙酸均為分析純，乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 混合單糖對(duì)照品衍生化供試液制備 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖各100mg，加水溶解，定容至100 mL。

取對(duì)照品溶液1 mL，依次加入PMP甲醇溶液（0.5 moL·L-1）和NaOH溶液（0.2 moL·L-1）各0.5 mL，混勻，70 ℃水浴100 min，冷卻，加入鹽酸溶液（0.2 mol·L-1）中和，混勻，三氯甲烷洗滌3次，每次2 mL，取水層，離心后上清液用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 色譜柱選擇 分別采用waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）三種色譜柱，考察色譜柱對(duì)混合對(duì)照品衍生化供試液色譜峰的影響。結(jié)果表明，Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱能對(duì)各衍生化組分進(jìn)行很好地分離。具體如圖1所示。

2.1.3 柱溫篩選 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，設(shè)定柱溫為25 ℃，30 ℃和35 ℃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫越高，保留時(shí)間越短，出峰越快。為節(jié)約時(shí)間，選取柱溫為35 ℃。

2.1.4 流動(dòng)相考察 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，設(shè)定流動(dòng)相為乙腈-水、乙腈-乙酸銨溶液（0.01 moL·L-1）、乙腈-乙酸銨溶液（0.02 moL·L-1）和乙腈-乙酸銨溶液（0.05 moL·L-1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸銨對(duì)峰形及分離度有改善作用，濃度越高，峰形對(duì)稱性越好，但對(duì)設(shè)備損傷較大。綜合考慮，流動(dòng)相選取乙腈-乙酸銨溶液（0.02 moL·L-1）。

2.2 太子參多糖水解方法篩選

2.2.1 水解用酸的考察 取6份太子參多糖（自制）各10 mg，加水1.0 mL溶解，分別加入3、5、7 moL·L-1鹽酸和1、3、5 moL·L-1三氟乙酸溶液各1.0 mL，混勻，110 ℃水解1 h，放冷，NaOH溶液中和，得太子參多糖水解液。

取上述6份多糖水解液各1.0 mL，照“2.1.1”項(xiàng)下處理后測(cè)定，其結(jié)果見表1。

實(shí)驗(yàn)表明，不同水解條件下4種單糖峰面積變化趨勢(shì)并不相同。綜合考慮，水解用酸選擇3 moL·L-1鹽酸溶液。

2.2.3 水解溫度考察

取3份太子參多糖各10 mg，加水1.0 mL溶解，分別加入鹽酸（3 mol·L-1）1.0 mL，混勻，分別在100 ℃、110 ℃、120 ℃水解1 h，放冷， NaOH溶液中和，得太子參多糖水解液。

取上述多糖水解液各1.0 mL，照“2.1.1”項(xiàng)下處理后測(cè)定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，水解溫度確定為110 ℃，其結(jié)果見表2。

2.2.4 水解時(shí)間考察 取3份太子參多糖各10 mg，加水1.0 mL溶解，加入鹽酸（3 moL·L-1）1.0 mL，混勻，于110 ℃分別水解30，60 和90 min，放冷， NaOH溶液中和，得太子參多糖水解液。

取上述多糖水解液各1.0 mL，照“2.1.1”項(xiàng)下處理后測(cè)定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，水解時(shí)間確定為30 min，具體見表3。

2.3 衍生化方法的篩選

2.3.1 衍生化溫度的篩選 取太子參多糖水解液3份，每份1.0 mL，置10 mL具塞試管中，依次加入PMP甲醇溶液（0.5 moL·L-1）和NaOH溶液（0.2 moL·L-1）各0.5 mL，混勻，分別于40 ℃，70 ℃，95 ℃水浴100 min，處理后進(jìn)樣測(cè)定。綜合考慮各單糖峰面積，將衍生化溫度確定為70 ℃，具體見表4。

2.3.2 衍生化時(shí)間的篩選 取太子參多糖水解液3份，每份各1.0 mL，依次加入PMP甲醇溶液（0.5 moL·L-1）和NaOH溶液（0.2 moL·L-1）各0.5 mL，混勻，于70 ℃水浴分別加熱30，60和100 min，處理后進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)各單糖峰面積的大小確定衍生化時(shí)間為100 min，具體見表5。

2.4 太子參藥材中多糖水解產(chǎn)物單糖的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.02 moL·L-1的乙酸銨溶液（19∶81）;檢測(cè)波長：250 nm;流速：1.0 mL·min-1;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.2 供試品溶液的制備及測(cè)定 供試品溶液的制備 精密稱取太子參粉末0.2 g，置索氏提取器中，用80 mL乙醇回流提取1 h。過濾，濾渣揮干乙醇后，加水40 mL回流提取4 h，趁熱抽濾，再加水30 mL回流提取2 h，抽濾，合并濾液，定容至100 mL。精密吸取1 mL定容至10 mL，作為供試品溶液。

測(cè)定法：取太子參供試品溶液1 mL，加鹽酸溶液（3.0 moL·L-1）1 mL，混勻，110 ℃水解30 min，放冷，NaOH溶液調(diào)pH值至中性。取1 mL，依次加入PMP甲醇溶液（0.5 mol·L-1）和NaOH溶液（0.2 moL·L-1）各0.5 mL，混勻，70 ℃水浴加熱100 min，冷卻，鹽酸溶液（0.2 moL·L-1）中和后定容至5 mL，混勻，三氯甲烷洗滌3次，每次2 mL，取水層，離心后將上清液過濾，取續(xù)濾液，測(cè)定，即得。

2.4.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品液、供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖（見圖2）。從圖中可見，供試品溶液和對(duì)照品溶液中鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的保留時(shí)間一致，且供試品溶液中各待測(cè)峰的分離度符合要求。

2.4.4 線性關(guān)系考察 取四種單糖濃度均為1 mg·mL-1的混合單糖對(duì)照品溶液，衍生化處理后測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量x（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸得到四種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表6。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取太子參藥材（1號(hào)）0.2 g，按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各單糖的峰面積，結(jié)果見表7。RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取太子參藥材（1號(hào)）0.2 g，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果見表8。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取太子參藥材（1號(hào)）0.2 g，按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于衍生化后0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果列入表9。RSD均小于2%，說明供試液衍生化后在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測(cè)定含量的樣品（樣品編號(hào)1號(hào)）各0.1g，置索氏提取器中，加乙醇回流提取1 h，濾渣揮干乙醇，再精密加入適量的鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖對(duì)照品，按照 “2.4.2”項(xiàng)下處理后測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表10～13。

2.4.9 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地的太子參藥材樣品，分別制備供試品溶液后測(cè)定，結(jié)果見表14。

結(jié)果表明：各批次太子參的單糖含量懸殊不是很大，且皆呈現(xiàn)出同樣趨勢(shì)：其含量木糖﹥半乳糖﹥鼠李糖﹥葡萄糖。各批次藥材中木糖和半乳糖含量均在10%以上，葡萄糖含量較低，大多在5%以下。

3 討論

本文采用柱前衍生化-HPLC法對(duì)太子參藥材中的鼠李糖、葡萄糖、半乳糖以及木糖進(jìn)行測(cè)定，分別對(duì)液相色譜條件、多糖水解和衍生化條件進(jìn)行了優(yōu)化，比較了不同條件下單糖衍生物的峰形、分離度、峰面積大小變化等，最終確定了太子參藥材中多糖水解產(chǎn)物單糖的含量測(cè)定方法。

對(duì)所建方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性均較好（回歸系數(shù)0.9999），精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于3%。在加樣回收率試驗(yàn)中，鼠李糖、半乳糖和木糖的平均回收率在95%～105%之間，且RSD﹤3%，符合要求。但葡萄糖的回收率偏低，平均值為86.04%，這可能與太子參藥材中葡萄糖含量較低且樣品前處理過程比較復(fù)雜有關(guān)。因此，在后續(xù)的太子參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作中，可優(yōu)先考慮將含量較高的鼠李糖、半乳糖和木糖納入質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

本文的研究工作，可為今后太子參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充完善提供研究基礎(chǔ)及數(shù)據(jù)支撐，對(duì)太子參的質(zhì)量控制具有一定的價(jià)值和意義。

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（收稿日期：2020-12-18 編輯：劉 斌）