臨時(shí)用重組人干擾素α-2b鼻腔噴霧劑的配制和穩(wěn)定性考察

阮麗梅，倪曉燕，呂鳳文，陸靜金，戴根苗，程鋼*（.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，國家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，合肥 300；.安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司，合肥 30088）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），簡稱“新冠肺炎”[1]，傳播迅速，潛伏時(shí)間長，主要傳播途徑為呼吸道飛沫傳播及密切接觸傳播[2-3]。為了減少新型冠狀病毒（SARSCoV-2）的傳播，應(yīng)加強(qiáng)直接接觸患者一線醫(yī)務(wù)人員的防護(hù)，在采用物理防控措施的基礎(chǔ)上，使用其他防護(hù)措施也是必要的。根據(jù)國家衛(wèi)生健康委《新型冠狀病毒肺炎診療方案》（試行第7 版）推薦，目前用于COVID-19 的抗病毒治療主要有α-干擾素（α-IFN）、洛匹那韋、利托那韋（LPVr）及利巴韋林等[4]。其中重組人干擾素α-2b（rhIFNα-2b，以下簡稱IFNα-2b）具有廣譜抗病毒、抑制細(xì)胞增殖以及提高免疫功能等作用。有研究表明α-干擾素的抗病毒機(jī)制可以預(yù)防病毒感染，持續(xù)用藥，可能會(huì)起到類似疫苗的作用，而使用干擾素噴霧劑可阻斷呼吸道病毒的快速傳播，起到預(yù)防作用[5-6]。國外研究報(bào)告了SARS-CoV-2 對(duì)重組人干擾素α和β（IFNα/β）的敏感性，證明了IFNα/β在抑制SARS-CoV-2 感染方面的潛在功效[7]，并推薦使用低劑量的IFNα-2b 在鼻腔噴霧（每日2次，每次0.5×106IU），配合羥氯喹口服（每日50 ～100 mg），用于臨床一線醫(yī)務(wù)人員，以預(yù)防COVID-19[8]。目前國內(nèi)已上市的IFNα-2b 噴霧劑沒有鼻腔噴霧劑型，一般為皮膚科外用噴霧劑，適用于由病毒引起的初發(fā)或復(fù)發(fā)性皮膚單純皰疹，并不能直接噴于鼻咽部[9-10]?；诖?，我們考慮配制IFNα-2b 鼻腔噴霧劑為醫(yī)護(hù)人員提供藥物預(yù)防，本研究以α-干擾素霧化方案為基礎(chǔ)，參考國內(nèi)外多項(xiàng)鼻腔噴霧劑的相關(guān)文獻(xiàn)[8，11-13]，確定了制劑的處方和用法，利用臨床常用的IFNα-2b 注射液和0.9%氯化鈉注射液配制臨時(shí)用噴霧溶液，灌封于鼻腔用噴霧裝置中，并考察噴霧劑的穩(wěn)定性，旨在為臨床一線醫(yī)護(hù)人員預(yù)防COVID-19 提供安全保障。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

IFNα-2b 注射液[安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司，規(guī)格：每支3.0×106IU，批號(hào)：20191230、20200206-1、20200206-2]，0.9%氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，規(guī)格：100 mL，批號(hào)：19110722），人羊膜成纖維細(xì)胞（WISH）、水皰性口炎病毒（VSV）株[安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司]，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTM，批號(hào)：20191021，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號(hào)：20191030，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器

生物安全柜（SW-CJ-1F 型，蘇州凈化設(shè)備有限公司），隔水式培養(yǎng)箱（GHP9080，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（FYL-YS-50LK，北京福意聯(lián)電器有限公司），CO2培養(yǎng)箱（HERAcell vios 160i，Thermo Scientific），倒置顯微鏡（XDS-1B，重慶光電儀器有限公司），pH計(jì)（FE20，MettlerToledo），光吸收讀板機(jī)（SpectraMax 190，Molecular Devices），多劑量鼻腔噴霧泵[規(guī)格：每噴100 μL，萬通（蘇州）定量閥系統(tǒng)有限公司]，無菌噴霧劑玻璃瓶[規(guī)格：10 mL，萬通（蘇州）定量閥系統(tǒng)有限公司]。

2 方法

2.1 鼻腔噴霧劑的制備

無菌條件下操作，取IFNα-2b 注射液（3.0×106IU∶1 mL）3 支，以一次性無菌注射器吸取并注入無菌噴霧劑玻璃瓶中，再加入0.9%氯化鈉注射液6 mL，裝入鼻腔噴霧泵，擰緊密封，并蓋上防污罩，在瓶身貼上標(biāo)簽，共制作3 批，批號(hào)標(biāo)注為A、B、C，分別對(duì)應(yīng)IFNα-2b 注射液批號(hào)20191230、20200206-1、20200206-2。

2.2 穩(wěn)定性考察

2.2.1 儲(chǔ)存溫度試驗(yàn) 將批號(hào)為A、B、C 的3 批樣品分別于（5±3）℃（以下簡稱5℃）、（25±2）℃（以下簡稱25℃）、（37±2）℃（以下簡稱37℃），相對(duì)濕度（60±10）%條件下避光貯存，分別于0 d、7 d、14 d、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月，按考察項(xiàng)目取樣檢測。

2.2.2 振搖試驗(yàn) 將3 批樣品于5℃條件下避光貯存，置于搖床上振搖，振動(dòng)幅度為±10°，振動(dòng)頻率為80 r·min－1。分別于0、7、14 d 按考察項(xiàng)目取樣檢測。

2.2.3 凍融試驗(yàn) 將3 批樣品于（－20±5）℃放置48 h 完全冷凍，再置于5℃放置48 h 完全解凍，為一個(gè)凍融循環(huán)，分別于2 次、4 次凍融后按考察項(xiàng)目取樣檢測。

2.2.4 模擬使用試驗(yàn) 將3 批樣品各取適量，模擬正常使用，每日4次，每次3噴，連續(xù)使用5 d，使用完畢后放置于5 ℃保存。分別于開始使用后的第1日、5日、1 個(gè)月、2 個(gè)月各取11 支樣品，按考察項(xiàng)目取樣檢測。

2.3 考察項(xiàng)目

依據(jù)《中國藥典》2015年版三部分別進(jìn)行外觀、pH 值、無菌、生物學(xué)活性檢測。

2.3.1 外觀性狀 手持樣品容器頸部于遮光板邊緣處，輕輕旋轉(zhuǎn)和翻轉(zhuǎn)容器，以明視距離（通常為 25 cm）分別于黑色和白色背景下用目檢視。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)為澄明液體，無肉眼可見異物。

2.3.2 pH 值 根據(jù)《中國藥典》2015年版第四部通則 0631 進(jìn)行檢測。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：pH 應(yīng)為6.5 ～7.5。

2.3.3 無菌 根據(jù)《中國藥典》2015年版第四部1101 無菌檢查法，采用薄膜過濾法處理樣品。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)無菌生長。

2.3.4 生物學(xué)活性 根據(jù)《中國藥典》2015年版第三部第一法細(xì)胞病變抑制法（CPE），以中國食品藥品檢定研究院頒發(fā)的干擾素標(biāo)準(zhǔn)品校正。根據(jù)干擾素可以保護(hù)人羊膜細(xì)胞免受水泡性口炎病毒破壞的作用，用結(jié)晶紫對(duì)存活的WISH 細(xì)胞染色，于波長570 nm 處測定其吸光度，可得到干擾素對(duì)WISH 細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)曲線，以此測定干擾素生物學(xué)活性。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)為標(biāo)示量的80%～150%，標(biāo)示量為每瓶900 萬IU/9 mL。

3 結(jié)果

3.1 不同儲(chǔ)存溫度考察結(jié)果

A、B、C 3 批樣品0 個(gè)月的生物學(xué)活性分別為標(biāo)示量的111%、111%和108%，于5℃、25℃存放3 個(gè)月、于37 ℃存放1 個(gè)月，3 批樣品生物學(xué)活性（%）在108%～137%，其他各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果也均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，表明本品在5℃、25℃條件下可存放3 個(gè)月、于37℃條件下可存放1 個(gè)月，見表1。

表1 3 批IFNα-2b 鼻腔噴霧劑在不同溫度下儲(chǔ)存不同時(shí)間的穩(wěn)定性Tab 1 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray stored at different temperatures and time

3.2 振搖試驗(yàn)考察結(jié)果

3 批樣品振搖試驗(yàn)14 d，期間檢測各項(xiàng)指標(biāo)，生物學(xué)活性（%）在102%～126%，其他各項(xiàng)檢測結(jié)果均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，表明振搖條件下本品至少能保存2 周，見表2。

表2 3 批IFNα-2b 鼻腔噴霧劑在振搖條件下的穩(wěn)定性Tab 2 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray under vibration conditions

3.3 凍融試驗(yàn)考察結(jié)果

3 批樣品在第2、4 次凍融循環(huán)后檢測各項(xiàng)指標(biāo)，生物學(xué)活性（%）在100%～137%，其他各項(xiàng)檢測結(jié)果均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，表明凍融4 次后本品穩(wěn)定性良好，見表3。

表3 3 批IFNα-2b 鼻腔噴霧劑凍融4 次的穩(wěn)定性Tab 3 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray freeze-thaw 4 times

3.4 藥品模擬使用后5℃儲(chǔ)存穩(wěn)定性

3 批樣品模擬使用5 d 后、5 ℃存放2 個(gè)月，結(jié)果生物學(xué)活性在99%～115%，其他各項(xiàng)檢測結(jié)果均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，表明模擬使用后本品仍能保存2 個(gè)月，見表4。

表4 3 批IFNα-2b 鼻腔噴霧劑模擬使用后5 ℃儲(chǔ)存的穩(wěn)定性Tab 4 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray stored at 5 ℃after the simulated test

4 討論

4.1 研究目的和意義

在疫情期間，國家衛(wèi)生健康委發(fā)布了系列方案、指南、通知等，根據(jù)醫(yī)務(wù)人員接觸COVID-19患者可能性及其暴露風(fēng)險(xiǎn)，提出分級(jí)防護(hù)措施[14]。但防護(hù)重點(diǎn)側(cè)重于物理隔離，比如戴口罩，穿隔離衣，戴護(hù)目鏡等，藥物預(yù)防則主要集中于中藥湯劑[15]，西藥預(yù)防未特別強(qiáng)調(diào)。α-2 型干擾素作為廣譜抗病毒藥，是《新型冠狀病毒肺炎診療方案》1 ～7 版推薦的主要治療藥物之一，推薦用法是大劑量霧化吸入（5.0×106IU/次，每日2 次），吸入的藥物顆粒沉積于氣道和肺部發(fā)揮療效。關(guān)于α-2型干擾素作為鼻腔預(yù)防用藥，在鼻腔發(fā)揮療效，則鮮有推薦報(bào)道，究其原因，是因?yàn)槊绹?0 世紀(jì)80年代臨床試驗(yàn)證實(shí)α-2 型干擾素對(duì)鼻黏膜有刺激作用（干黏膜、結(jié)痂、血涕等）[16-18]，從而限制了噴霧劑作為呼吸道病毒感染預(yù)防用藥的使用，至今美國FDA 未批準(zhǔn)該劑型上市，中國亦然。而近期較多的研究表明，小劑量應(yīng)用IFNα-2b 鼻腔噴霧，可有效防治各類病毒性上呼吸道疾病，包括預(yù)防COVID-19[8，19]，且不良反應(yīng)并不明顯。醫(yī)院藥學(xué)人員因地制宜，于靜配中心生物安全柜內(nèi)無菌操作，用IFNα-2b 注射液和0.9%氯化鈉注射液配制臨時(shí)用鼻腔噴霧劑，在保證關(guān)鍵質(zhì)量的前提下，可迅速供給一線醫(yī)務(wù)人員使用。

4.2 噴霧劑處方與用法的思考

國內(nèi)對(duì)IFNα-2b 鼻腔噴霧劑的劑量和安全性相關(guān)研究集中于2003年SARS 疫情之后，在參考國外報(bào)道的基礎(chǔ)上，陳清團(tuán)隊(duì)[11-13]進(jìn)行了大樣本（＞4000 人）的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，成人日劑量1.8×106IU，每日用藥2 次，每次兩側(cè)鼻腔、咽喉各一噴，連續(xù)使用5 d，結(jié)果不良反應(yīng)輕微，且均為可逆性反應(yīng)，未出現(xiàn)血涕和嚴(yán)重不良反應(yīng)報(bào)告，這可能與使用劑量低、用藥時(shí)間短有關(guān)[12]。本次COVID-19 疫情發(fā)生之后，有國外研究再次推薦使用低劑量IFNα-2b 鼻腔噴霧預(yù)防COVID-19[8]，日劑量1.0×106IU，每日鼻內(nèi)噴霧2 次，既可減輕由SARS-CoV-2 引起的感冒癥狀，又可最大程度地降低IFNα-2b 的不良反應(yīng)。

本試驗(yàn)在參照國內(nèi)外研究的基礎(chǔ)上，將噴霧劑的處方定為：IFNα-2b 注射劑3 支（3.0×106IU/支）與0.9%氯化鈉注射液6 mL 混合配制而成，相當(dāng)于噴霧劑中IFNα-2b 的含量為1.0×106IU·mL－l；用0.9%氯化鈉作溶劑是為了維持滲透壓，保持等滲狀態(tài)[20]。推薦用法為：每日2 ～3 次，每次兩側(cè)鼻腔各1 噴、咽喉2 噴，以每噴量100 μL 計(jì)，相當(dāng)于日劑量0.8×106～1.2×106IU，與文獻(xiàn)預(yù)防推薦量（日劑量1.0×106IU）接近[8]；使用時(shí)間為5 d，達(dá)到預(yù)防效果的同時(shí)避免嚴(yán)重不良反應(yīng)。適用人群為臨床一線健康和有輕度呼吸道病毒感染癥狀的醫(yī)務(wù)人員。從本院醫(yī)務(wù)人員的使用情況反饋來看，用藥耐受性良好，未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，用藥人員均未發(fā)生呼吸道病毒感染（包括COVID-19）。

4.3 穩(wěn)定性考察結(jié)果分析

由于IFNα-2b 注射劑處方中含有人血白蛋白，為生物制劑，對(duì)各種環(huán)境條件的改變較敏感，本試驗(yàn)考察了樣品在不同溫度下儲(chǔ)存的穩(wěn)定性，在5℃條件下穩(wěn)定性良好，至少可保存3 個(gè)月；在25℃和37℃條件下也可以保存一段時(shí)間，提示在臨床使用中即使忘記放入冰箱冷藏，短時(shí)間內(nèi)也依舊安全有效；通過凍融試驗(yàn)和振搖試驗(yàn)表明樣品在極端環(huán)境下儲(chǔ)存和顛簸的運(yùn)輸過程中依然可以保持良好的穩(wěn)定性；模擬使用5 d 后的穩(wěn)定性考察表明，用藥結(jié)束后于5℃放置2 個(gè)月，各項(xiàng)檢測指標(biāo)均未發(fā)生較大變化，說明噴霧裝置的密閉性良好，能充分防止微生物和細(xì)菌的進(jìn)入，在必要時(shí)可繼續(xù)使用。

4.4 制劑的優(yōu)點(diǎn)與展望

鼻噴霧劑的處方通常包括原藥、防腐劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑及緩沖劑等輔料，但是有的藥用輔料有一定的毒性，可能會(huì)對(duì)制劑安全性產(chǎn)生影響[21-22]，而本試驗(yàn)配制的鼻噴霧劑直接用0.9%氯化鈉注射液稀釋而成，未添加其他輔料，可以避免輔料的毒副作用；國內(nèi)上市的2 種IFNα噴霧劑商品名為捷撫（IFNα-2b，10 mL∶1.0×106IU，120 噴/瓶）和運(yùn)德素（IFNα-1b，5 mL∶0.25×106IU），規(guī)格劑量小，即使可以臨時(shí)替代使用，但要達(dá)到1.0×106IU 的日劑量，需要噴120 噴（用完整瓶）或以上，臨床不易接受。而本次試驗(yàn)配制的規(guī)格（9 mL∶9.0×106IU）每日只需噴8 ～12 噴，一瓶能保證5 ～7 d用量，使用方便。試驗(yàn)采用的無菌噴霧裝置易于在市場上購得，利用醫(yī)院靜脈配置中心的無菌條件即可完成配制，不需要其他特殊設(shè)備，操作簡單，現(xiàn)配現(xiàn)用，特別適合新冠疫情等臨時(shí)性突發(fā)公共事件下對(duì)藥物特殊劑型的需求。

有研究表明，在治療COVID-19 時(shí)，干擾素霧化吸入可以產(chǎn)生氣溶膠污染空氣，增加醫(yī)護(hù)人員和患者交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)[23-24]，而本試驗(yàn)配制的噴霧劑與霧化吸入相比，不受使用環(huán)境及霧化設(shè)備的限制，患者依從性好，不易產(chǎn)生氣溶膠污染環(huán)境。但其能否在輕癥COVID-19 患者的治療中代替霧化吸入治療，從而減少交叉感染，需要繼續(xù)深入研究。當(dāng)然，IFNα-2b 鼻噴霧劑在預(yù)防中還缺乏相關(guān)的臨床研究，其有效性和安全性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。