黃芪增益方對小鼠免疫功能的影響

田俊娜，王婷婷，王雙，趙思俊*，樸晉華*，張蕻（.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 03069；.山西省食品藥品檢驗(yàn)所，太原 03003）

免疫力是人體自身的一種防御機(jī)制，是人體識別和消滅外來入侵異物，清除衰老、死亡、病變細(xì)胞的能力，對維持生理生命活動(dòng)具有十分重要的意義[1-3]。免疫力低下會(huì)誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生，嚴(yán)重影響人們的身體健康[4-5]。黃芪增益方是在六味地黃湯基礎(chǔ)上化裁重組，去其“三泄”，取其“三補(bǔ)”，加黃芪[6]和黨參[7]，強(qiáng)化其增強(qiáng)免疫功能而制成的復(fù)方中藥。本文通過小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺[8]制備免疫低下模型小鼠，評價(jià)黃芪增益方對小鼠的免疫功能的保健作用。

1 材料

1.1 儀器

HEMAET 950FS 五分類動(dòng)物血液分析儀（美國DREM），YJ13B-G 煎藥機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限公司），ZC/LS-25A 電動(dòng)耳腫打耳器（上海洛維生物科技有限公司），TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），渦旋混勻器（德國IKA）。

1.2 試藥

黃芪增益方，按黃芪-黨參-熟地黃-山茱萸-山藥＝3∶3∶4∶2∶2 的比例稱取中藥飲片，加10 倍量水煎煮兩次，每次1 h，合并濾液，85 ℃濃縮至1 g（生藥）·mL－1，得黃芪增益方水提液。經(jīng)紫外分光光度計(jì)，采用蒽酮-硫酸法，得出方中多糖含量為65.72%。

匹多莫德分散片（北京金城泰爾制藥有限公司，批號：190706），注射用環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)有限公司，批號：04200501），2，4-二硝基氟苯（DNFB，麥克林，批號：C10654004），印度墨汁（Phygene，批號：20200710），小鼠免疫球蛋白A（lgA）及小鼠白介素4（IL-4）ELASA試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司，批號：202012、202012）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級ICR 小鼠，雄性，240 只，體質(zhì)量18 ～22 g [斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，合格證號110324200101980161]，飼養(yǎng)于SPF 級動(dòng)物室，環(huán)境溫度控制在20 ～25℃，相對濕度40%～70%，12 h 明暗交替，小鼠可自由攝食飲水。

2 方法

2.1 模型的制備與分組給藥

取小鼠90 只，分為6 組，即空白組，模型組，陽性藥組，黃芪增益方高、中、低劑量組，每組15 只?？瞻捉M與模型組以純化水10 mL/（kg·d）灌胃；陽性組以匹多莫德分散片0.12 g/（kg·d）灌胃，高劑量組以9.6 g（生藥）·kg－1、中劑量組4.8 g（生藥）·kg－1、低劑量組2.4 g（生藥）·kg－1灌胃，灌胃體積10 mL /（kg·d），連續(xù)給藥4 周。在第3 周后開始腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/（kg·d）造模，空白組動(dòng)物腹腔注射0.9%氯化鈉注射液10 mL/（kg·d），每日一次，連續(xù)3 d，制備免疫功能低下模型小鼠。造模期間，連續(xù)給藥，直至給藥結(jié)束。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.2.1 外周血白細(xì)胞數(shù)量的測定 給藥4 周后，從小鼠眼內(nèi)眥靜脈采血于抗凝管中，送全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測定白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量。

2.2.2 小鼠臟器指數(shù)的計(jì)算 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱取各組小鼠體重后，拉頸處死小鼠，取脾臟和胸腺，濾紙吸取表面殘留血液、水分，稱量脾臟、胸腺重量，計(jì)算臟器指數(shù)。小鼠胸腺指數(shù)＝胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；小鼠脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

2.2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力 取小鼠脾臟，無菌操作，制成單細(xì)胞懸液，用Hank’s 液洗細(xì)胞2 次，每次離心10 min（1000 r·min－1），取1 mL RPMI1640 細(xì)胞完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106個(gè)·mL－1。將細(xì)胞懸液加入24 孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，每只小鼠脾細(xì)胞設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，一孔加75 μL ConA 液（終濃度7.5 μg·mL－1），另一孔作為空白對照，37℃5%CO2培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL 不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT（5 mg·mL－1）50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL DMSO，充分震蕩，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每孔分裝3 孔作為平行樣，用酶標(biāo)儀，在570 nm 波長處，測定光密度值（OD）。用加ConA 孔的OD減去不加 ConA 孔的OD代表淋巴細(xì)胞增殖能力，分別比較各組與空白對照組的OD差值的情況。

2.2.4 小鼠組織病理 取各組脾臟、胸腺、骨髓組織用固定液固定，石蠟包埋、切片，HE 染色，顯微鏡下觀察小鼠脾臟、胸腺、胸骨骨髓病理變化。

2.2.5 小鼠血清中l(wèi)gA、IL-4 的測定 采用ELASA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作，檢測血清中l(wèi)gA、IL-4 的含量。

2.2.6 對正常小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響 取ICR 小鼠，隨機(jī)分為空白組，陽性藥組，黃芪增益方高、中、低劑量組，每組15 只，給藥劑量同“2.1”項(xiàng)下。給藥4 周后，稱取小鼠體質(zhì)量，從小鼠尾靜脈注入0.1%Na2CO3稀釋的印度墨汁（1∶25，0.1 mL/10 g）。2、10 min 后分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，用紫外分光光度計(jì)在600 nm 波長處測定其光密度值（OD），分別記為OD1和OD2，以0.1%Na2CO3溶液作空白對照，計(jì)算校正系數(shù)（K），K＝（lgOD1－lgOD2）/（t2－t1）。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱質(zhì)量。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力，吞噬指數(shù)＝體質(zhì)量/（肝質(zhì)量＋脾質(zhì)量）×K1/3。

2.2.7 對正常小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用 取ICR 小鼠，分為空白組，陽性藥組，模型組，黃芪增益方高、中、低劑量組，每組15 只，給藥劑量同“2.1”項(xiàng)下。給藥3 周后，將小鼠腹部脫毛，范圍約 3 cm×3 cm、用 DNFB 溶液50 μL 均勻涂抹致敏造模。5 d 后，取10 μL DNFB 溶液（10 mg·mL－1）均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊，攻擊后 24 h 后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8 mm 的耳片，稱重，以左右耳重量之差作為腫脹度。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，方差齊且呈正態(tài)分布的計(jì)量資料采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間有差異者進(jìn)一步采用 Dunnet-t檢驗(yàn)分析，其他計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)兩兩比較等非參數(shù)檢驗(yàn)（本實(shí)驗(yàn)中脾淋巴細(xì)胞方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)）。

3 結(jié)果

3.1 對免疫功能低下小鼠的影響

3.1.1 一般情況 空白組小鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，毛色光滑；模型組小鼠蜷縮，活動(dòng)不佳，毛色欠佳，粗糙，蓬松；與模型組相比，黃芪增益方各劑量組和陽性對照組小鼠精神狀態(tài)較好，明顯優(yōu)于模型組，毛色較光滑。

3.1.2 對小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量的影響 與空白組相比，模型組白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，黃芪增益方高劑量組、陽性組白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），黃芪增益方中劑量嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P＜0.01），提示黃芪增益方可上調(diào)免疫功能低下小鼠的外周血細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞免疫（見圖1）。

圖1 黃芪增益方對免疫抑制小鼠外周血細(xì)胞的影響Fig 1 Effect of Huangqi Zengyi formula on the peripheral blood cells of immunosuppressive mice

3.1.3 對小鼠臟器指數(shù)的影響 由圖2可知，模型組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯低于空白組（P＜0.01），環(huán)磷酰胺可使小鼠免疫功能受到抑制，提示免疫低下模型小鼠制備成功。與模型組相比，黃芪增益方高劑量組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.01），說明其可促進(jìn)免疫低下小鼠免疫器官的發(fā)育。

圖2 黃芪增益方對小鼠臟器指數(shù)的影響Fig 2 Effect of Huangqi Zengyi formula on the organ index

3.1.4 對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 由圖3可以看出，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著低于空白組（P＜0.01）；與模型組相比，高劑量組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著提高（P＜0.01），提示黃芪增益方可能增強(qiáng)免疫低下小鼠的細(xì)胞免疫功能。

圖3 黃芪增益方對免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Fig 3 Effect of Huangqi Zengyi formula on the splenic lymphocyte transformation in immunosuppressive mice

3.1.5 對小鼠組織病理的影響 生物光學(xué)顯微鏡下觀察各組織病理變化，見圖4～6。脾臟空白組白髓與紅髓分布均勻，而模型組紅髓偏多，且出現(xiàn)空泡狀。與模型組相比，黃芪增益方各劑量組白髓顯著增多，且分布均勻，說明淋巴細(xì)胞增多?？瞻捉M可見胸腺細(xì)胞分布均勻，未發(fā)現(xiàn)組織細(xì)胞病變壞死，而模型組胸腺組織稀疏，胸腺細(xì)胞減少。與模型組相比，黃芪增益方各劑量組胸腺細(xì)胞顯著增多。骨髓空白組可見骨髓細(xì)胞分布均勻，而模型組骨髓細(xì)胞明顯稀疏。與模型組相比，黃芪增益方各劑量組胸骨骨髓細(xì)胞明顯增多，提示黃芪增益方可改善免疫抑制小鼠免疫器官脾、胸腺與骨髓的免疫功能。

圖4 黃芪增益方對小鼠脾臟病理形態(tài)影響（HE，200×）Fig 4 Effect of Huangqi Zengyi formula on the pathomorphology of spleen in mice（HE，200×）

圖5 黃芪增益方對小鼠胸腺病理形態(tài)影響（HE，200×）Fig 5 Effect of Huangqi Zengyi formula on the pathomorphology of the thymus in mice（HE，200×）

圖6 黃芪增益方對小鼠胸骨骨髓病理形態(tài)影響（HE，400×）Fig 6 Effect of Huangqi Zengyi formula on the pathomorphology of the sternal bone marrow in mice（HE，400×）

3.1.6 對小鼠血清中l(wèi)gA、IL-4 的調(diào)節(jié)作用 與空白組相比，模型組血清中細(xì)胞因子lgA、IL-4含量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，除低劑量組之外，其余各劑量組lgA、IL-4 均上調(diào)（P＜0.01），提示黃芪增益方可通過上調(diào)免疫低下小鼠血清體液因子的含量，增強(qiáng)體液免疫功能（見表1）。

表1 黃芪增益方對小鼠細(xì)胞因子lgA、IL-4 水平的影響Tab 1 Effect of Huangqi Zengyi formula on the level of cytokines lgA and IL-4 in mice

3.2 對正常小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

與空白組相比，陽性藥組，黃芪增益方高、中劑量組吞噬指數(shù)顯著升高（P＜0.01），結(jié)果見圖7，提示黃芪增益方可能通過促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高機(jī)體固有免疫應(yīng)答。

圖7 黃芪增益方對正常小鼠巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞的影響Fig 7 Effect of Huangqi Zengyi formula on the phagocytes of macrophages in normal mice

3.3 對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的抑制作用

與空白組相比，模型組小鼠耳廓腫脹度明顯升高（P＜0.01），與模型組相比，黃芪增益方高、中劑量組對耳腫脹度有明顯抑制作用（P＜0.01），提示黃芪增益方具有增強(qiáng)免疫的作用，結(jié)果見圖8。

圖8 黃芪增益方對小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的抑制作用Fig 8 Effect of Huangqi Zengyi formula on the delayed allergic in mice

4 討論

免疫系統(tǒng)包括免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子，共同發(fā)揮作用保護(hù)人體免受病原體的侵害[9]。胸腺和脾臟是主要的免疫器官，在產(chǎn)生和維持免疫細(xì)胞中起著至關(guān)重要的作用[10-12]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體抗病原生物入侵的第一道防線，吞噬病原生物并將抗原信息呈遞給T 細(xì)胞激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)[13]。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要細(xì)胞，在人體的外周血和淋巴液中循環(huán)，促進(jìn)機(jī)體的體液免疫與細(xì)胞免疫，參與抗癌的重要細(xì)胞[14-15]。

2020年版《允許保健食品聲稱的保健功能目錄 非營養(yǎng)素補(bǔ)充劑（征求意見稿）》中關(guān)于增強(qiáng)免疫力功能部分新增，可采用免疫功能低下的模型動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此本實(shí)驗(yàn)采用免疫低下模型與正常小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用腹腔注射環(huán)磷酰胺建議免疫低下模型[16-18]。在脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，對ConA液濃度進(jìn)行了預(yù)試，分別采用終質(zhì)量濃度為4、5、6、7.5、8、9、10、11 μg·mL－1，結(jié)果表明，7.5 μg·mL－1是刺激脾淋巴細(xì)胞增殖的最佳濃度。

本文探討了黃芪增益方對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明，連續(xù)給藥4 周后，免疫低下模型小鼠外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)顯著升高，且胸腺、脾臟指數(shù)顯著升高；脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著提高；HE 染色結(jié)果表明黃芪增益方可改善免疫器官與胸骨骨髓的免疫功能；ELASA 實(shí)驗(yàn)表明黃芪增益方可顯著提高細(xì)胞因子lgA、IL-4 的表達(dá)；黃芪增益方對非特異免疫也具有很好的效果，可顯著提高免疫抑制小鼠的單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力；在細(xì)胞免疫中，隨著黃芪增益方劑量的增大，小鼠耳腫脹度呈現(xiàn)顯著降低趨勢；說明黃芪增益方可增強(qiáng)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，黃芪增益方可從多方面改善免疫狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體免疫效果，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步進(jìn)行深入的探究。