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    包載姜黃素的羧甲基化白及多糖-殼聚糖聚電解質(zhì)復(fù)合膜對(duì)大鼠口腔潰瘍的治療作用研究

    2021-09-04 07:21:46王玉蓉巨佳王濟(jì)趙慧雯林瑤黃靜薛曉娟馮斌成黎霏軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心陜西省口腔生物工程技術(shù)研究中心第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科西安70032陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西咸陽72046
    中南藥學(xué) 2021年8期
    關(guān)鍵詞:藥膜載藥復(fù)合膜

    王玉蓉,巨佳,王濟(jì),趙慧雯,林瑤,黃靜,薛曉娟,馮斌,成黎霏*(.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,陜西省口腔生物工程技術(shù)研究中心,第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院 藥劑科,西安70032;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 72046)

    口腔潰瘍屬于中醫(yī)中口瘍、口瘡的范疇[1],是一種常發(fā)生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥,通常具有自發(fā)性和復(fù)發(fā)性[2]??谇粷儠?huì)導(dǎo)致疼痛,嚴(yán)重影響患者飲食和說話,降低患者的生活質(zhì)量[3-4]。

    姜黃素(curcumin,Cur)是從姜科植物姜黃的干燥根莖中提取的主要有效成分。研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗病毒、抗感染等藥理活性,且不良反應(yīng)少[5]。近幾年有研究表明Cur 對(duì)口腔疾病牙周炎[6]和口腔潰瘍[7]等有顯著效果。但因其幾乎不溶于水,生物利用度低,限制了其臨床應(yīng)用。

    本課題組前期采用生物可降解性的白及多糖(Bletilla striatapolysaccharide,BSP)和殼聚糖(chitosan,CS)為原材料,通過醚化法[8]對(duì)BSP進(jìn)行羧甲基化改性,改性后的BSP 與帶正電的CS 通過靜電作用[9]形成聚電解質(zhì)復(fù)合物,制備了用于治療口腔潰瘍的載有Cur 的羧甲基化白及多糖-殼聚糖(CMBSP-CS)聚電解質(zhì)復(fù)合膜。

    本研究采用冰醋酸灼傷化學(xué)方法[10]建立大鼠口腔潰瘍模型,通過HE 染色法考察前期制備的包載Cur 的CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜[11]對(duì)大鼠口腔潰瘍愈合的影響,通過ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清和組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的變化,以期明確CMBSP-CS 對(duì)大鼠口腔潰瘍的治療作用及其可能的作用機(jī)制,為該制劑的應(yīng)用研發(fā)提供依據(jù)。

    1 材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF 級(jí)雄性SD 大鼠72 只,體質(zhì)量(200±20)g [第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(軍)2012-0007]。

    1.2 試藥

    包載Cur 的CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜[實(shí)驗(yàn)室自制,平均厚度為(74.0±2.0)μm,載藥量為95.41%,體外累積釋放度可達(dá)93.78%],空白膜(實(shí)驗(yàn)室自制);大鼠TNF-αELISA 試劑盒(F18960)、IL-6 ELISA 試劑盒(F1887)、IL-1βELISA 試劑盒(F1917)、BCA 試劑盒(W1117)(上海西唐生物科技有限公司);山羊封閉血清(中杉金橋);Triton(Sigma 公司);NP-40 裂解液、P0413F(上海碧云天);醋酸(批號(hào):190522,富宇精細(xì)化工);生理鹽水(批號(hào):190506,山東科倫);水為純化水(實(shí)驗(yàn)室自制);水合氯醛、多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

    1.3 儀器

    DW-86L386-80℃超低溫冰箱(海爾);Leica RM2125RTS 石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡);AX-84 光學(xué)顯微鏡(日本Olympus);DENLEY DRAGON Wellscan MK3 酶標(biāo)儀、Wellwash 4 MK2洗板機(jī)(芬蘭Thermo);PYX-DHS,4002×500數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);TGL-168、11-07 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);20 ~200 μL 移液槍(Thermo labsystems);XW-80A 漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠);DHG-9023A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);0.1 ~50 mL 連續(xù)分液器(TOMOS LIFE SCIENCE Group);高通量組織研磨器(寧波新芝)。

    2 方法

    2.1 動(dòng)物模型的建立

    將72 只雄性大鼠放在晝夜交替、溫濕度分別為(24±2)℃和40%~60%的房間適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后稱重,隨機(jī)分成正常組、模型組、空白膜組和藥膜組,每組18 只。模型組、空白膜組和藥膜組用 10%水合氯醛溶液按照0.3 mL/100 g腹腔注射給藥用于麻醉,將直徑為 5 mm 的脫脂棉球塞入內(nèi)徑為0.5 cm 的移液槍槍頭中,用50 μL 50%醋酸溶液浸潤(rùn)后垂直緊貼于大鼠下唇口腔黏膜表面處,持續(xù)按壓 60 s 后移除棉球并用 5 mL 生理鹽水連續(xù)沖洗,以此建立大鼠口腔潰瘍模型。正常組則使用生理鹽水代替,其余操作不變。造模 24 h 后,觀察大鼠造模區(qū)局部黏膜的情況,如果形成約為0.5 cm 的潰瘍,且周圍有充血、紅腫和假膜則表明潰瘍成功形成[12-13]。

    2.2 給藥方法

    大鼠在給藥前,采用10% 的水合氯醛腹腔麻醉,將空白復(fù)合膜與CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜裁剪為0.5 cm2大小備用,給藥時(shí)貼于大鼠口腔潰瘍患處,輕壓20 s 以保證膜劑與患處貼合緊密。造模成功當(dāng)日開始給藥,每日給藥一次,連續(xù)給藥7 d。正常組與模型組麻醉后不做處理。用藥后2 h 內(nèi)禁食禁水,其余時(shí)間自由進(jìn)食進(jìn)水[12]。

    2.3 大體觀察

    造模成功后觀察動(dòng)物外觀、精神及一般狀況的變化,肉眼觀察各組潰瘍愈合程度,每日測(cè)量并記錄大鼠體質(zhì)量的變化。

    2.4 大鼠潰瘍局部組織和血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量測(cè)定

    各組于造模成功后第3日和第7日各隨機(jī)選取6 只動(dòng)物眼眶取血后處死。待血液凝固后,4000 r·min-1離心5 min,分離血清,分裝保存于-80℃?zhèn)溆?。藥膜組、空白膜組和模型組切取潰瘍組織黏膜,正常組切取正常黏膜,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗組織以去除殘留血液,將黏膜剪碎后置于 EP 管中稱重后加入NP-40 裂解液,用細(xì)胞超微粉碎機(jī)對(duì)黏膜進(jìn)行充分粉碎。將粉碎得到的組織勻漿置于高速離心機(jī)中4℃、5000 r·min-1離心20 min 后用移液器移取上清液后分裝保存于-80℃冰箱中備用,按 ELISA 試劑盒說明書操作進(jìn)行上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的測(cè)定。

    2.5 潰瘍組織病理學(xué)觀察

    各組于造模成功后第3日與第7日各隨機(jī)選取3 只大鼠處死取得黏膜標(biāo)本后,將黏膜標(biāo)本用生理鹽水沖洗干凈后立即放入 4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定,用石蠟對(duì)組織進(jìn)行包埋后,連續(xù)4 μm切片,HE 染色,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察分析。

    2.6 統(tǒng)計(jì)分析

    應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示,兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sigma Plot 12.5 軟件作出圖像分析。

    3 結(jié)果

    3.1 CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜對(duì)口腔潰瘍愈合的作用

    3.1.1 大體觀察 對(duì)大鼠精神狀況、毛發(fā)和運(yùn)動(dòng)的觀察采用盲法進(jìn)行,觀察結(jié)果顯示,正常組大鼠反應(yīng)靈敏,背毛光澤,二便和活動(dòng)正常;模型組大鼠反應(yīng)遲鈍,口唇邊潮濕,流口水,毛發(fā)粗糙分叉,大便偏??;給藥組反應(yīng)靈敏,背毛光澤,活動(dòng)正常。

    3.1.2 體質(zhì)量變化 造模第3日,與正常組比較,模型組、藥膜組與空白膜組大鼠體質(zhì)量變化顯著降低(P<0.05);與模型組相比,藥膜組體質(zhì)量變化顯著升高(P<0.05)。說明醋酸處理使大鼠產(chǎn)生疼痛與不適導(dǎo)致了大鼠體質(zhì)量下降,給予一次藥膜能夠減少大鼠的體質(zhì)量下降。

    第4日,與模型組相比,藥膜組大鼠體質(zhì)量變化顯著升高(P< 0.05),與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示,給予兩次藥膜處理能夠使大鼠體質(zhì)量變化恢復(fù)到正常水平。第5日,與模型組相比,空白膜組大鼠體質(zhì)量變化有顯著上升趨勢(shì),與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    第6 ~8日,各組大鼠體質(zhì)量間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示實(shí)驗(yàn)開始6 d 后口腔潰瘍對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響消失(見圖1)。

    3.1.3 創(chuàng)面愈合情況 成功建模后第 3、5、7日分別觀察各組大鼠口腔潰瘍情況(觀察前用純凈水沖洗各組潰瘍處,去除藥膜等殘留物以便觀察)。結(jié)果顯示,正常大鼠各時(shí)間點(diǎn)口腔黏膜表面光滑,無水腫,無充血現(xiàn)象(見圖2A ~C);建模后第3日,模型組、空白膜組和藥膜組造模區(qū)黏膜水腫,形成黃白色假膜(見圖2D、G、J)。建模后第 5日,空白膜組黃白色假膜變?。ㄒ妶D2H);藥膜組黃白色假膜已經(jīng)完全脫落,腫脹程度減輕,組織周圍充血減輕(見圖2K);建模后第7日,模型組黃白色假膜未完全脫落(見圖2F);空白膜組黃白色假膜完全脫落(見圖2I);藥膜組有明顯的愈合現(xiàn)象,腫脹現(xiàn)象基本消失,周圍組織充血消失(見圖2L)。結(jié)果表明,藥膜組口腔潰瘍愈合速度最快,說明載藥復(fù)合膜治療能夠明顯加速口腔潰瘍的愈合;其次為空白膜組,說明膜材中的CMBSP-CS 對(duì)口腔潰瘍的愈合有一定的促進(jìn)作用;最后為模型組,驗(yàn)證了口腔潰瘍具有自愈性。

    圖2 不同處理組大鼠口腔潰瘍發(fā)展過程Fig 2 Development of oral ulcers in rats in different treatment groups

    3.2 組織病理學(xué)觀察

    由圖3可知,正常組大鼠口腔黏膜上皮完整連續(xù),無血管充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變(見圖3A、B)。造模成功后第3日,除正常組外,其余各組大鼠黏膜皮層、棘層、基底層均破壞消失,固有層直接暴露,細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性,潰瘍部位有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)有少量的紅細(xì)胞外滲(見圖3C、E、G);第7日,模型組基底細(xì)胞層開始呈現(xiàn)修復(fù)反應(yīng),但炎性細(xì)胞浸潤(rùn)依舊明顯(見圖3D);空白膜組有新的肉芽組織產(chǎn)生,但仍有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖3F);藥膜組潰瘍部位棘層、基底層逐漸修復(fù),炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,黏膜組織結(jié)構(gòu)趨于完整(見圖3H)。結(jié)果表明,藥膜組口腔潰瘍愈合速度最快,其次為空白膜組,說明載藥復(fù)合膜治療能夠明顯加速口腔潰瘍的愈合,膜材中的CMBSP-CS 對(duì)口腔潰瘍的愈合也有一定的促進(jìn)作用。

    圖3 口腔黏膜 HE 染色圖片(100×,n =3)Fig 3 HE staining picture of oral mucosa(100×,n =3)

    3.3 大鼠口腔潰瘍組織和血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的檢測(cè)

    由圖4可知,造模成功后第3日,與正常組相比,模型組、空白膜組、藥膜組口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量顯著增加(P<0.05)造模成功后第7日,與正常組相比,模型組、空白膜組、藥膜組口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量仍顯著增加(P<0.05),但與第3日比較含量有所下降;與模型組相比,藥膜組與空白膜組口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量顯著下降(P<0.05),其中藥膜組效果顯著優(yōu)于空白膜組(P<0.05)。結(jié)果顯示,給予6 次藥膜處理對(duì)大鼠潰瘍組織和血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量減少的影響最為顯著,其次為空白膜組,最后是模型組,結(jié)果也表明口腔潰瘍具有自愈性。

    圖4 大鼠口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量(± s,n =6)Fig 4 Content of TNF-α、IL-1β、IL-6 in rat oral ulcer tissue and serum(± s,n =6)

    4 討論

    本研究以醋酸化學(xué)灼傷建立的創(chuàng)傷性口腔潰瘍大鼠模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過大體觀察、創(chuàng)面愈合情況及組織病理學(xué)觀察評(píng)價(jià)CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜與空白膜對(duì)口腔潰瘍的治療作用,研究結(jié)果顯示CMBSP-CS 載藥復(fù)合膜及空白膜對(duì)口腔潰瘍均有一定的治療作用,載藥復(fù)合膜的效果最為明顯,說明空白膜可以協(xié)同Cur 一同起到治療口腔潰瘍的作用,載藥復(fù)合膜是一個(gè)藥輔合一的制劑,具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。研究中觀察到CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜能夠減少口腔潰瘍大鼠的體質(zhì)量下降,推測(cè)載藥復(fù)合膜可能產(chǎn)生了一定的鎮(zhèn)痛效果,Cur 是中藥姜黃中的有效成分之一,《中國(guó)藥典》中記載:“姜黃可用于胸脅剌痛,閉經(jīng),徵瘕,風(fēng)濕肩臂疼痛,跌撲腫痛”。說明可能與Cur 的鎮(zhèn)痛作用有關(guān);多次給予空白復(fù)合膜能夠使大鼠體質(zhì)量變化恢復(fù)到正常水平,這可能與膜材中CMBSP-CS 的抗炎、抗菌作用及CS 提高免疫力等作用有關(guān)。

    本研究還通過大鼠口腔潰瘍組織和血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的檢測(cè)對(duì)CMBSP-CS載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜的口腔潰瘍治療作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索,結(jié)果表明CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜可明顯降低口腔潰瘍組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平[14-18],從而減少炎癥的發(fā)生,但是其分子免疫機(jī)制和對(duì)口腔潰瘍中其他因子的影響尚不清楚。下一步課題組將圍繞其是否具有鎮(zhèn)痛作用及具體的作用機(jī)制繼續(xù)進(jìn)行研究。

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