芫荽的抗氧化活性及對(duì)高果糖高鹽飲食誘導(dǎo)大鼠血壓升高的緩解作用

劉玥玥，李 婷，張 博，王曉淵，董欣悅，吳俊峰，王 輝，楊興斌

（陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院/陜西省食品綠色加工與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室/陜西省農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏危害因素評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710119）

高血壓作為常見的慢性病，已成為發(fā)展中國(guó)家主要的公共衛(wèi)生問題。我國(guó)高血壓調(diào)查最新數(shù)據(jù)顯示，2012—2015年成人高血壓患病率已達(dá)27.9%（標(biāo)化率23.2%）[1]。高血壓以動(dòng)脈血壓升高為主要臨床表征[2]，常常伴隨著多種并發(fā)癥，嚴(yán)重者可能導(dǎo)致心力衰竭、腎衰竭等。高鈉飲食、超重和肥胖是高血壓發(fā)病的主要誘因[3-4]，但長(zhǎng)期服用降壓藥物可能帶來頭疼、耳鳴、惡心等副作用[1，5]。目前，有研究表明中藥復(fù)方制劑可緩解血壓升高[6-7]，但相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在已經(jīng)形成高血壓的模型動(dòng)物上加以干預(yù)，雖然能夠一定程度上緩解有關(guān)癥狀，卻難以恢復(fù)到正常水平[8]。

芫荽又名香菜，是傘形科芫荽屬一年生草本植物[9]。相關(guān)研究顯示芫荽含有豐富的雌二醇、雌三醇和黃酮等，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[10]。大量研究表明，氧化應(yīng)激與高血壓的發(fā)病密切相關(guān)[11]。已有研究證實(shí)，芫荽可降低總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量[12]。中醫(yī)學(xué)研究也有以芫荽全草入藥，用于緩解血壓升高的記錄[13]。但目前尚無直接利用芫荽改善動(dòng)物血壓的干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究。為此，作者在評(píng)估芫荽抗氧化活性基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建高果糖高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型，系統(tǒng)探究芫荽干預(yù)對(duì)飲食誘導(dǎo)的大鼠血壓升高的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑新鮮芫荽：購(gòu)自西安市長(zhǎng)安區(qū)華潤(rùn)萬家超市；普通標(biāo)準(zhǔn)飼料（以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)）（不含果糖的碳水化合物67%，蛋白質(zhì)20%，脂肪13%）：Envigo公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器LGJ-10C冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司產(chǎn)品；KQ-500DB超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；無創(chuàng)血壓儀：Kent scientific公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芫荽樣品制備將當(dāng)日所購(gòu)新鮮芫荽清洗后置于干凈培養(yǎng)皿內(nèi)，于-20℃放置過夜后冷凍干燥，粉碎后過100目篩網(wǎng)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗氧化能力測(cè)定研究顯示，芫荽黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取物展現(xiàn)出良好的活性效果[14-15]，故采用70%乙醇提取芫荽中活性成分后再通過測(cè)定提取物對(duì)DPPH自由基、羥自由基的清除能力及其還原能力評(píng)估芫荽的體外抗氧化活性。參考常馨月等的方法[16]并稍做修改。稱取芫荽凍干粉1 g，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡30 min（料液質(zhì)量體積比為1 g∶30 mL），室溫超聲30 min。于4 000 r/min離心5 min后取上清液備用。

1）DPPH自由基清除能力的測(cè)定 當(dāng)體系中有抗氧化劑存在時(shí)，DPPH的乙醇溶液在517 nm下的強(qiáng)吸收將減少甚至消失，通過分析吸光值變化判定芫荽醇提物的抗氧化能力。參照文獻(xiàn)[17]所述的改良方法分析芫荽對(duì)DPPH的清除能力。將1 mL待測(cè)芫荽醇提物和1 mL新鮮制備的0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液短暫混合，在室溫下避光反應(yīng)30 min，測(cè)定其在517 nm處的吸光值。用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇替換芫荽樣品，設(shè)置為陰性對(duì)照。空白對(duì)照則用無水乙醇替換DPPH溶液。根據(jù)公式（1）計(jì)算芫荽樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。

式中：As為樣品溶液的吸光值；Ab為空白對(duì)照溶液的吸光值；A0為陰性對(duì)照溶液的吸光值。

2）羥自由基清除能力的測(cè)定 芫荽醇提物的羥基自由基清除效應(yīng)參照胡曉等[17]所述的改良方法測(cè)定。將1 mL 2.5 mmol/L 1，10-鄰菲咯啉無水乙醇溶液和1 mL待測(cè)芫荽醇提物混勻后，加入1 mL 2.5 mmol/L FeSO4混 勻，加 入1 mL的20 mmol/L H2O2，在37℃下保溫90 min后在536 nm處測(cè)定其OD值，記為As。用1 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇替換1 mL待測(cè)芫荽醇提物，記為A0。以1 mL的無水乙醇替換1 mL的2.5 mmol/L 1，10-鄰菲咯啉，記為Ab。根據(jù)公式（2）計(jì)算芫荽對(duì)羥自由基的清除率。

式中：As為樣品溶液的吸光值；Ab為空白對(duì)照溶液的吸光值；A0為陰性對(duì)照溶液的吸光值。

3）總還原能力測(cè)定 芫荽醇提物的總還原能力通過胡曉等[17]所述的改良方法測(cè)定。取芫荽醇提物2.5 mL加入2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L），加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液，混勻后50℃水浴20 min，取出后迅速冷卻至室溫。加入2.5 mL體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸，4 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵和4 mL蒸餾水后震蕩混勻，15 min后于700 nm處測(cè)吸光值，記為As。加入1 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇替換1 mL待測(cè)芫荽醇提物，記為A0。加入等量的蒸餾水替換質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀、體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵，記為Ab。根據(jù)公式（3）計(jì)算芫荽的總還原能力。

式中：As為樣品溶液的吸光值；Ab為空白對(duì)照溶液的吸光值；A0為陰性對(duì)照溶液的吸光值。

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)采用32只健康雄性SD大鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量（185±5）g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分成4組，包括正常飼料組（NC）、模型組（M）、芫荽低劑量組（LP）和芫荽高劑量組（HP），每組8只。NC組老鼠的飼養(yǎng)使用標(biāo)準(zhǔn)飼料和普通飲用水，M、LP、HP 3組老鼠的飲食為高果糖飼料和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%鹽水。所有大鼠允許自由飲水，實(shí)驗(yàn)開始一周后對(duì)LP組大鼠按1 g/（kg·d）劑量灌胃芫荽凍干粉溶液，HP組大鼠按2 g/（kg·d）劑量灌胃芫荽凍干粉溶液，NC和M組大鼠灌胃等量生理鹽水。將大鼠飼養(yǎng)于12 h光照、12 h黑暗的晝夜光變化周期及溫度（22±2）℃的環(huán)境下。每天于同一時(shí)間記錄每組動(dòng)物攝食量和飲水量，每周于同一時(shí)間稱重并測(cè)量動(dòng)脈血壓。

喂養(yǎng)7周后，大鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥鈉，待大鼠麻醉后心臟取血，處死。收集血液后離心取上層血清，用于測(cè)定甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）含量。

1.2.4 血壓測(cè)量利用無創(chuàng)血壓儀測(cè)量大鼠尾部收縮壓、舒張壓及血壓平均值。測(cè)試前讓大鼠體溫達(dá)到37.0℃并處于黑暗環(huán)境。每個(gè)樣本重復(fù)讀取15個(gè)數(shù)據(jù)，取穩(wěn)定數(shù)值的平均值代表大鼠血壓，并據(jù)此計(jì)算平均動(dòng)脈壓。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，結(jié)果用x±SD表示。采用SPSS 23.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用GraphPad Prism 8.0分析軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芫荽體外抗氧化能力評(píng)估結(jié)果

2.1.1 芫荽體外DPPH自由基清除能力芫荽凍干粉經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%乙醇超聲提取后所得提取物的體外DPPH自由基清除能力如圖1所示。在供試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，陽性對(duì)照維生素C（VC）的DPPH自由基清除率一直維持在較高水平。芫荽醇提物在0.41~3.30 g/L范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基清除率呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴性，其DPPH自由基清除能力隨質(zhì)量濃度增大而明顯增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為3.30 g/L時(shí)芫荽醇提物的DPPH清除率達(dá)87.75%，接近同質(zhì)量濃度下VC的DPPH自由基清除率（94.42%）。

圖1 芫荽醇提物的體外DPPH自由基清除能力Fig.1 In vitro DPPH free radical scavenging ability of ethanolic extract of coriander

2.1.2 芫荽體外羥自由基清除能力如圖2所示，在供試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，陽性對(duì)照VC的羥自由基清除能力均在75%以上并且保持穩(wěn)定上升趨勢(shì)。在0.41~6.60 g/L范圍內(nèi)，芫荽醇提物對(duì)羥自由基清除能力呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，其羥自由基清除能力隨質(zhì)量濃度升高而明顯增強(qiáng)。當(dāng)芫荽醇提物質(zhì)量濃度為6.60 g/L時(shí)，其羥自由基清除率達(dá)到76.70%，雖低于同質(zhì)量濃度下VC的羥自由基清除率，但是仍然展現(xiàn)出良好的羥自由基清除能力。

2.1.3 芫荽體外還原能力還原能力是評(píng)價(jià)天然抗氧化劑抗氧化能力的重要指標(biāo)。圖3（a）所示為芫荽醇提物和VC的還原能力隨質(zhì)量濃度增加的關(guān)系結(jié)果圖，圖3（b）為不同質(zhì)量濃度芫荽醇提物和VC將三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵所顯示出的顏色變化。芫荽醇提物的還原能力隨著質(zhì)量濃度的升高顯著增強(qiáng)，6.60 g/L芫荽醇提物的還原能力達(dá)77.43%，0.82 g/L VC的還原能力達(dá)到87.26%，更高質(zhì)量濃度的VC溶液因反應(yīng)液顏色過深而未被檢測(cè)到。

圖2 芫荽醇提物的體外羥自由基清除能力Fig.2 In vitro hydroxyl radical scavenging ability of ethanolic extract of coriander

圖3 芫荽醇提物的體外還原能力Fig.3 In vitro reducing ability of ethanolic extract ofcoriander

芫荽作為一種天然調(diào)味食品，其所含主要活性成分黃酮被證明是芫荽具有抗氧化等生物活性的重要原因[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6.60 g/L芫荽醇提物的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力分別達(dá)89.28%、76.70%和77.43%。方瑞那等研究發(fā)現(xiàn)芫荽中黃酮類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除率最大達(dá)89.70%，對(duì)羥自由基清除率最大達(dá)82.49%[18]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，也說明芫荽具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。

機(jī)體在維持正常生命活動(dòng)過程中會(huì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，從而誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生。當(dāng)自由基在機(jī)體內(nèi)大量聚積時(shí)則會(huì)損壞正常細(xì)胞和組織，從而引發(fā)心血管病、腫瘤等慢性疾病[19]。有研究表明，機(jī)體內(nèi)多余的活性氧或自由基會(huì)損壞腎臟系統(tǒng)，使機(jī)體易感于高血壓等病癥，這也是高血壓的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制[20]。因此，探尋可有效激活細(xì)胞固有抗氧化途徑或增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的策略對(duì)于保護(hù)機(jī)體腎臟系統(tǒng)不被破壞、維持鈉平衡和正常血壓尤為重要[21]。近年來，抗氧化應(yīng)激在心血管疾病防治中的應(yīng)用引起了國(guó)內(nèi)外眾多研究者的關(guān)注，事實(shí)上，抗氧化劑在高血壓臨床應(yīng)用中已取得一定的成效[20]。據(jù)此推測(cè)，具有良好抗氧化能力的芫荽可能具有潛在的降血壓和心腦血管保護(hù)效應(yīng)。

2.2 芫荽可緩解高糖高鹽飲食引起的大鼠體質(zhì)量增加

由圖4（a）可知，與普通飲食相比，高果糖高鹽飲食誘使大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度顯著加快，而芫荽干預(yù)可明顯緩解高糖高鹽飲食誘導(dǎo)的大鼠體質(zhì)量增加。經(jīng)8周喂養(yǎng)后，模型組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)量達(dá)到273.30 g，顯著高于正常組大鼠（182.10 g），而相較于模型組，低劑量和高劑量芫荽干預(yù)后，大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)量分別下降至199.00 g和176.40 g（見圖4（b），P<0.05）。如圖4（c）所示，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，4組大鼠的攝食量緩慢增加，維持相對(duì)穩(wěn)定，且4組之間無顯著差異。在飲水量方面，模型組大鼠的飲水量明顯高于正常組大鼠，而芫荽干預(yù)后大鼠飲水量有所下降（見圖4（d））。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，所有大鼠健康狀況穩(wěn)定，未出現(xiàn)臨床不良癥狀。

圖4 大鼠的體質(zhì)量、攝食量與飲水量變化情況Fig.4 Changes in body weight，food and water intake of rats

2.3 芫荽可降低高糖高鹽飲食誘導(dǎo)的大鼠血壓升高

高鈉飲食、超重和肥胖是我國(guó)居民高血壓主要的發(fā)病危險(xiǎn)因素[3]。為還原我國(guó)居民高血壓發(fā)病本質(zhì)，作者利用高果糖高鹽飲食構(gòu)建膳食誘導(dǎo)的高血壓模型，同時(shí)以高、低兩個(gè)劑量芫荽凍干粉灌胃大鼠，探究芫荽對(duì)膳食誘導(dǎo)血壓升高的預(yù)防作用。大鼠血壓變化情況如圖5和表1所示。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)4組大鼠的血壓基本保持在同一水平。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，正常組大鼠的收縮壓保持基本穩(wěn)定（14.0 kPa左右），模型組大鼠收縮壓隨時(shí)間穩(wěn)步上升，收縮壓超過18.6 kPa是比舒張壓更重要的心血管疾?。–VD）危險(xiǎn)因素[22-23]。在第5周時(shí)模型組大鼠收縮壓升高至19.2 kPa，之后維持基本穩(wěn)定。而芫荽粉干預(yù)后，大鼠血壓基本維持在正常水平，未顯示明顯的升高，提示其可顯著降低高糖高鹽引起的收縮壓升高（見圖5（a））。舒張壓監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，4組大鼠舒張壓并未呈現(xiàn)明顯的規(guī)律變化，組間無顯著性差異（見圖5（b））。大鼠喂養(yǎng)7周后，模型組大鼠收縮壓升高5.3 kPa，與NC組（0.59 kPa）相比有顯著性提高（P<0.05），而相較于模型組，低劑量和高劑量芫荽干預(yù)組大鼠收縮壓增量分別顯著降低至0.53 kPa（P<0.05）和-1.04 kPa（P<0.05）。值得注意的是，大鼠經(jīng)高劑量芫荽長(zhǎng)時(shí)間干預(yù)后，與初始血壓相比，其收縮壓和舒張壓均出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。

圖5 芫荽對(duì)大鼠血壓的影響Fig.5 Effect of coriander on blood pressure of rats

表1 大鼠血壓增長(zhǎng)量Table 1 Blood pressure increase of rats

平均動(dòng)脈壓（MAP）是指一個(gè)心動(dòng)周期中動(dòng)脈血壓的平均值，反映心臟的功能以及外周大動(dòng)脈的阻力情況。在數(shù)值上，平均動(dòng)脈壓更接近收縮壓，但在臨床研究上，平均動(dòng)脈壓相較于單一的舒張壓或者收縮壓更有意義，其對(duì)于推動(dòng)血液流向全身各個(gè)器官有著重要的作用，與心、腦、腎血流的供應(yīng)和分配關(guān)聯(lián)十分密切，故平均動(dòng)脈壓能為臨床治療提供更多有用的信息[24]，例如在預(yù)測(cè)高血壓患者心血管死亡時(shí)，平均動(dòng)脈壓比收縮壓或舒張壓更加有效[25]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過分析平均動(dòng)脈壓的變化情況來評(píng)估芫荽粉對(duì)高糖高鹽飲食誘導(dǎo)血壓升高的預(yù)防作用。圖5（c）所示為根據(jù)收縮壓和舒張壓測(cè)量結(jié)果計(jì)算得到的大鼠MAP結(jié)果。4組大鼠的MAP變化趨勢(shì)與收縮壓大致相同。實(shí)驗(yàn)過程中正常組大鼠MAP始終維持在正常水平。經(jīng)7周喂養(yǎng)后，模型組大鼠MAP則升高至21.11 kPa，顯著高于NC組（15.8 kPa），而相較于模型組，高劑量和低劑量芫荽組大鼠MAP分別顯著下降至15.7、14.6 kPa，趨于正常水平。該結(jié)果表明芫荽干預(yù)可有效減緩高果糖高鹽飲食誘導(dǎo)的大鼠平均動(dòng)脈壓升高。值得注意的是，由試驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)大鼠的血壓數(shù)據(jù)及血壓增長(zhǎng)量結(jié)果可知，芫荽的高血壓預(yù)防效果與其劑量有關(guān)，高劑量芫荽組大鼠的血壓下降幅度明顯大于低劑量組，且高劑量組的終點(diǎn)血壓略低于正常對(duì)照組（見圖5和表1）?；谝陨辖Y(jié)果，推測(cè)芫荽粉對(duì)高血壓的緩解作用可能存在劑量閾值，且對(duì)于原發(fā)性低血壓患者而言，過量的芫荽攝入可能會(huì)繼續(xù)降低其血壓水平，進(jìn)而加重其眩暈、心悸等癥狀[26-27]，因此對(duì)芫荽的使用劑量及食用過量芫荽是否會(huì)加重原發(fā)性低血壓病情還需要進(jìn)一步的分析論證。

2.4 芫荽可拮抗高糖高鹽飲食誘發(fā)的TC、TG、HDL-C和LDL-C的異常改變

除血壓變化外，高血壓患者常伴有高脂血癥、高血糖等并發(fā)癥，因此，監(jiān)測(cè)血壓的同時(shí)檢測(cè)糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)對(duì)于血壓升高癥狀是否得到緩解具有一定的提示作用[28-29]。圖6所示為大鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C含量，由圖可知，高果糖高鹽飲食喂養(yǎng)的模型組大鼠血清中TC、TG和LDLC含量均高于正常組大鼠，HDL-C含量低于正常組大鼠，其中TC和TG含量展現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）。而芫荽干預(yù)可不同程度地拮抗高糖高鹽飲食誘發(fā)的TC、TG、HDL-C和LDL-C的異常改變，尤其是，每天攝入2 g/kg芫荽粉顯著降低高糖高鹽飲食所誘發(fā)的大鼠血清TC、TG和LDL-C含量的升高（P<0.05）?；?7例高血壓病例和103名正常居民的一項(xiàng)血脂代謝對(duì)比研究顯示，高血壓組TC、TG和LDL-C水平均顯著高于正常組（P<0.05），HDL-C水平則低于正常組，經(jīng)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，TC、TG和LDL-C水平與血壓升高癥狀成正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芫荽可顯著改善高糖高鹽飲食誘導(dǎo)的大鼠脂質(zhì)代謝異常和體質(zhì)量增加（見圖4和圖6）。該系列結(jié)果進(jìn)一步印證了芫荽對(duì)高果糖高鹽飲食誘導(dǎo)大鼠血壓升高的緩解作用。

圖6 芫荽對(duì)大鼠血清脂質(zhì)代謝的影響Fig.6 Effect of coriander on serum lipid metabolism in rats

3 結(jié)語

芫荽醇提物展現(xiàn)出良好的體外DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和還原能力。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芫荽粉可有效緩解高糖高鹽飲食誘發(fā)的大鼠體質(zhì)量增加、血壓升高和脂質(zhì)代謝異常。經(jīng)高果糖高鹽飲食喂養(yǎng)7周后的大鼠平均動(dòng)脈壓（21.2 kPa）顯著高于正常飼料喂養(yǎng)的大鼠（15.8 kPa），而高劑量和低劑量芫荽粉分別干預(yù)7周后，大鼠平均動(dòng)脈壓分別下降至15.7、14.5 kPa，趨于正常水平。綜上所述，芫荽具有良好的體外抗氧化能力，并且可有效預(yù)防高果糖高鹽飲食導(dǎo)致的大鼠血壓升高。本研究為開發(fā)基于芫荽的有效防治高血壓的膳食補(bǔ)充劑或藥物提供科學(xué)依據(jù)。