葛葉總黃酮的提取工藝優(yōu)化及抗菌抗氧化能力研究

魏磊 王偉 侯玥瑩 謝曉陽(yáng) 周雍 陳飛 劉雨晴 崔煒 王韜 景炳年

摘要 [目的]優(yōu)化葛葉總黃酮提取工藝，并分析其抑菌抗氧化活性。[方法]以黃酮類化合物的提取量為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間為因素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化葛葉總黃酮的超聲提取工藝。采用二倍稀釋法測(cè)定葛葉總黃酮對(duì)7種常見致病菌的最低抑菌濃度（MIC），以考察其抗菌活性，并通過測(cè)定OH-、DPPH和ABTS自由基的清除活性來考察其抗氧化活性。[結(jié)果]葛葉總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度85%，液料比48∶1（mL∶g），超聲溫度73 ℃，超聲時(shí)間90 min，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明黃酮提取量為26.38 mg/g，接近理論值;抗菌活性研究結(jié)果表明，葛葉總黃酮的最小抑菌濃度為4～32 mg/mL，表明葛葉總黃酮具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用;OH-、DPPH和ABTS自由基清除試驗(yàn)IC50分別為1.78、1.58和0.86 mg/mL，表明葛葉總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性。[結(jié)論]該研究可為葛葉黃酮資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 葛葉總黃酮;響應(yīng)面分析;提取優(yōu)化;抗菌;抗氧化

中圖分類號(hào) R 284 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2021）14-0152-05

Abstract [Objective]The objective is to optimize the ultrasonic extraction technology of total flavonoids from ?Pueraria lobate ?leaves （FPL） and investigate its antibacterial and antioxidant activities. [Method]Using the extraction amount of flavonoids as response value， the ultrasonic extraction technology of FPL was optimized by response surface methodology on the basis of single factor test with ethanol concentration， liquidsolid ratio， ultrasonic temperature and time as factors. The minimal inhibit concentration （MIC） of FPL on 7 kinds of common pathogens were detected by double broth dilution method， so as to investigate antibacterial activities， and the antioxidant activities were investigated through the measurement of OH-， DPPH， and ABTS scavenging activity. [Result]The results showed optimal ultrasonic extraction technology of FPL included ethanol concentration 85%， liquidsolid ratio 48∶1（mL∶g）， ultrasonic temperature 73 ℃ and time 90 min. Under these conditions， the amount of flavonoids was 26.38 mg/g. Measured value agreed well with predicted value. Results of antibacterial activities study showed that MIC were in the range of 4-32 mg/mL. FPL showed significant antibacterial activities. The IC50 of OH-，DPPH， and ABTS scavenging activity were 1.78， 1.58 and 0.86 mg/mL， respectively. And the scavenging effect has a doseeffect relationship with the concentration of FPL. The optimized ultrasonic extraction technology of FPL is stable and feasible. [Conclusion] The results can provide a scientific basis for the exploitation and utilization of flavonoids resources of ?Pueraria lobate ?leaves.

Key words Total flavonoids of ?Pueraria lobate ?leaves;Response surface methodology;Extraction optimization;Antibacterial;Antioxidant

基金項(xiàng)目 河南省科學(xué)院基本科研項(xiàng)目（200613024）;河南省科學(xué)院科技開放合作項(xiàng)目（200913009）。

作者簡(jiǎn)介 魏磊（1986—），男，河南新鄉(xiāng)人，助理研究員，博士，從事中藥化學(xué)研究。*通信作者，助理研究員，博士，從事植物化學(xué)及分子生物學(xué)研究。

收稿日期 2020-11-16;修回日期 2020-12-24

葛（ Pueraria lobate ）為豆科葛屬多年生藤本植物，除新疆、青海和西藏以外，分布全國(guó)[1]。葛全身是寶，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。根入藥，有解表退熱、生津止渴、升陽(yáng)止瀉的功能[2];葉有收斂止血、消腫止痛等作用，主治創(chuàng)傷出血、跌打損傷[3]。根入藥后留下大量的葉，或被丟棄，或用于飼料，浪費(fèi)或降低了葉的利用價(jià)值，尤其是藥用價(jià)值。目前對(duì)葛資源研究開發(fā)主要集中于葛根作為中藥材的加工利用，而對(duì)葛葉的開發(fā)利用較少。

葛葉中有多種藥效成分，主要活性物質(zhì)包括葛根素、大豆苷、黃豆苷等黃酮類化合物[4]。目前已有葛葉總黃酮提取工藝和含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道，主要是對(duì)乙醇濃度、提取溫度及用石油醚預(yù)提等條件單獨(dú)進(jìn)行初步分析[5]，或是正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取方案，但關(guān)于葛葉總黃酮的超聲輔助響應(yīng)面法系統(tǒng)提取方法優(yōu)化卻鮮見報(bào)道。此外，葛根及葛花[6]中總黃酮已被證實(shí)有抗氧化功效，而葛葉中總黃酮抗氧化活性較少見相關(guān)報(bào)道。

鑒于黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等廣泛的生理及藥理活性[7]，響應(yīng)面法能夠?qū)Χ喾N影響提取效率的因素及之間相互作用進(jìn)行有效性系統(tǒng)分析[8]，超聲波提取技術(shù)具有提取效率高、耗能低、不破壞活性成分的優(yōu)點(diǎn)[9]，因此響應(yīng)面法結(jié)合超聲輔助提取技術(shù)在優(yōu)化黃酮類化合物[10-11]的提取工藝中得到廣泛應(yīng)用。

因此，筆者采用響應(yīng)面法優(yōu)化葛葉總黃酮的超聲輔助提取工藝，并考察葛葉總黃酮對(duì)人體常見致病菌的抑制作用及抗氧化能力，旨在為葛葉總黃酮的進(jìn)一步研究及葛葉的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛葉采自河南省南陽(yáng)市南召縣，烘干后粉碎過40目篩，備用;人體常見致病菌包括金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 25922、化膿性鏈球菌ATCC 19615、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、肺炎鏈球菌ATCC 49619、銅綠假單胞菌 ATCC 27853、肺炎克雷伯氏菌ATCC 700603，購(gòu)于南京便診生物科技有限公司;葛根素，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;牛肉浸膏，購(gòu)于北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;胰蛋白胨，購(gòu)于上海寶錄生物科技有限公司;96孔板，購(gòu)于美國(guó)Corning公司;OH-、DPPH、ABTS，購(gòu)于梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司;亞硝酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉等為分析純，購(gòu)自北京化工廠;無水三氯化鋁為分析純，購(gòu)于天津市福晨化學(xué)試劑廠。

ME-204型電子天平;KQ-500E型超聲波清洗儀;EYELAN-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;TU-1810型紫外分光光度計(jì);XMTD-7000型恒溫水浴鍋;SYQ-DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋;wi93008型麥?zhǔn)媳葷醿x;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱;YJ-VS-2型超凈工作臺(tái);Bio-rad iMarkTM型酶標(biāo)儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葛葉總黃酮提取流程。

稱取1.00 g葛葉粉于100 mL錐形瓶中，以相應(yīng)液料比加入設(shè)定濃度的乙醇溶液，在特定溫度下超聲提取一定時(shí)間，重復(fù)提取3次，合并濾液后濃縮定容，取適量測(cè)定溶液中總黃酮含量。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

以葛根素為標(biāo)準(zhǔn)品，采用分光光度法測(cè)定總黃酮含量。稱取標(biāo)準(zhǔn)品4.00 mg，50%乙醇溶液定容至10 mL容量瓶中。分別準(zhǔn)確移取0、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 mL該溶液于25 mL容量瓶中，加30%乙醇溶液至10 mL，再加入5% NaNO2溶液0.3 mL搖勻后靜置10 min，加入10% AlCl3溶液0.3 mL，搖勻后靜置10 min，加入5% NaOH溶液4.00 mL，加超純水至刻度，搖勻，靜置15 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（ A ）為縱坐標(biāo)，以葛根素質(zhì)量濃度（ C ）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為 A=0.012 4C-0.000 7，R2 =1.000 0。說明葛根素標(biāo)準(zhǔn)品在3.2～48.0 μg/mL線性關(guān)系良好。

1.2.2.2 總黃酮含量測(cè)定。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算提取液中總黃酮含量。提取量[mg（總黃酮）/g（干葛葉）]計(jì)算公式：

總黃酮提取量=（總黃酮質(zhì)量濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)/葛葉質(zhì)量）×1 000

1.2.3 葛葉提取單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

選定乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）作單因素試驗(yàn)，然后進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8進(jìn)行分析，對(duì)4因素3水平共29組試驗(yàn)結(jié)果分析優(yōu)化葛葉總黃酮提取方案，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和結(jié)果分別見表1、2。

1.2.4 葛葉總黃酮制備。

用響應(yīng)面優(yōu)化的提取方案提取葛葉總黃酮得到乙醇提取液后進(jìn)行抽濾，濃縮后加入2倍體積的無水乙醇，低溫靜置過夜以除去大部分多糖，真空冷凍干燥得到葛葉粗黃酮，并將其配置成濃度為256 mg/mL的母液，進(jìn)行后續(xù)活性試驗(yàn)研究。

1.2.5 葛葉總黃酮抑菌作用研究。

1.2.5.1 菌種復(fù)蘇及菌懸液制備。

上述7種常見致病菌復(fù)蘇后接種于固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～24 h，挑取單個(gè)菌落混懸于液體培養(yǎng)基中，使用麥?zhǔn)媳葷醿x檢測(cè)菌液濃度，將各菌種制成106～108 CFU/mL的菌懸液。

1.2.5.2 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的檢測(cè)。

用微量二倍稀釋法測(cè)定葛葉總黃酮的MIC。將“1.2.4”中制備的藥液過0.22 μm濾膜，用液體培養(yǎng)基依次倍比稀釋9個(gè)濃度，即128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 mg/mL;然后依次分別加入96孔板中，每孔100 μL;再分別加入“1.2.5.1”中各種菌懸液，每孔100 μL。每種分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（只加入100 μL菌液和100 μL液體培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照（只加200 μL液體培養(yǎng)基）。96孔板于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過夜觀察結(jié)果，MIC為完全沒有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)的最低濃度。將無菌生長(zhǎng)的各孔取樣，分別涂布于固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，以平板上無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MBC。

1.2.6 葛葉總黃酮抗氧化活性研究。

1.2.6.1 OH-自由基清除作用。

向1 mL葛葉總黃酮系列溶液（濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL）中依次滴加2 mL FeSO4（1.6 mmol/L）、3 mL水楊酸-乙醇溶液（1.6 mmol/L）和 2 mL H2O2（1.5 mmol/L），充分混勻，加超純水定容于10 mL容量瓶中，37 ℃水浴加熱反應(yīng)15 min后于510 nm處測(cè)定吸光度。以抗壞血酸和葛根素為陽(yáng)性對(duì)照，超純水為空白對(duì)照。重復(fù)測(cè)定3次取平均值。清除率公式：

OH-清除率（%）=（1- A1/A2）×100

式中，A1為樣品或陽(yáng)性對(duì)照吸光度值;A2 為空白對(duì)照吸光度值。

1.2.6.2 DPPH自由基清除作用。

參照Blois[12]的方法測(cè)定。取葛葉總黃酮系列溶液（濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL）100 μL，加入100 μL DPPH（0.2 mmol/L），充分混勻，避光靜置30 min后，以抗壞血酸和葛根素為陽(yáng)性對(duì)照，超純水為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)吸光值。重復(fù)測(cè)3次取平均值，清除率公式同“1.2.6.1”。

1.2.6.3 ABTS自由基清除作用。

參照Re等[13]的方法測(cè)定。反應(yīng)體系中，系列濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL，以抗壞血酸和葛根素為陽(yáng)性對(duì)照，超純水為空白對(duì)照。重復(fù)測(cè)3次取平均值，清除率公式同“1.2.6.1”。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度。

設(shè)定液料比30∶1、超聲溫度50 ℃、時(shí)間50 min，考察不同乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）對(duì)葛葉總黃酮提取量的影響，結(jié)果見圖1。從圖1可見，提取量隨乙醇濃度的增加而增大，在乙醇濃度80%葛葉總黃酮達(dá)到最大值，之后下降明顯。這可能是由于葛葉總黃酮極性與80%乙醇相似，故選擇80%乙醇為最佳提取濃度。

2.1.2 液料比。

設(shè)定乙醇濃度80%、超聲溫度50 ℃、提取時(shí)間50 min，考察不同液料比（10∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1）對(duì)葛葉總黃酮提取量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨液料比的增大提取量逐漸增大，當(dāng)液料比大于40∶1，總黃酮提取量增加不明顯，本著節(jié)約試劑的原則，選擇最佳液料比為40∶1。

2.1.3 超聲溫度。

設(shè)定乙醇濃度80%、液料比40∶1、超聲時(shí)間50 min，考察不同溫度（30、40、50、60、65、70、75 ℃）對(duì)葛葉總黃酮提取量的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可見，65 ℃時(shí)提取量最高，之后提取量下降，這可能是由于溫度過高會(huì)影響黃酮分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性而發(fā)生了轉(zhuǎn)化或降解，故選擇65 ℃為最佳提取溫度。

2.1.4 超聲時(shí)間。

設(shè)定液料比40∶1、乙醇濃度80%、超聲溫度65 ℃，考察不同超聲時(shí)間（20、40、60、80、100 min）對(duì)葛葉總黃酮提取量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，提取量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，80 min達(dá)到最大，此后不升反降。這可能是由于超聲時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)使黃酮發(fā)生一些轉(zhuǎn)化反應(yīng)，同時(shí)雜質(zhì)溶出也會(huì)增加，反而降低了提取量，故選擇最佳提取時(shí)間為80 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化葛葉總黃酮提取工藝

2.2.1 不同因素對(duì)提取效果的影響。

采用Design-Expert 8軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程： Y=26.49+2.09A+1.99B+0.79C-2.12D+1.59AB+0.027AC+0.90AD+1.01BC +1.22BD-0.63CD-6.88A2-6.54B2-1.08C2-1.87D2。 方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映影響的方向。由方程的二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，推斷方程代表的拋物面開口向下，具有極值點(diǎn)，可以進(jìn)行優(yōu)化分析。

對(duì)擬合模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，回歸模型極顯著（ P <0.000 1），而誤差項(xiàng)不顯著，說明回歸方程與實(shí)際情況吻合較好，試驗(yàn)誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

決定系數(shù) R 2和調(diào)整決定系數(shù)AdjR2分別為0.975 3和0.950 6，說明該模型擬合度良好;預(yù)測(cè)決定系數(shù)PredR2為0.900 4，說明該模型預(yù)測(cè)性良好。信噪比Adeq Precision為19.864，說明方程的擬合度和可信度較高，試驗(yàn)誤差較小。失擬項(xiàng) P 值0.784 2（ P >0.05），表示所使用的模型與具體試驗(yàn)結(jié)果吻合程度高，失擬項(xiàng)不顯著。方程中 A、B、D、A2、B2、D2 對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲時(shí)間（D）對(duì)提取量影響最顯著。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析。

從圖5可知，響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲線，說明響應(yīng)值存在極高值，6 個(gè)圖形的等高線中心均位于-1～1，表明葛葉總黃酮提取最優(yōu)條件存在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍之內(nèi)。響應(yīng)面坡度陡峭程度可以反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，響應(yīng)面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于因素的改變?cè)矫舾?，反之曲面越平緩表明因素的改變?duì)于響應(yīng)值的影響越小[14]。圖5直觀地反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，乙醇濃度和液料比、液料比和超聲時(shí)間交互作用曲面陡峭，表明其對(duì)葛葉總黃酮提取量的交互作用明顯。

2.2.3 最佳條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)。

用Design-Expert 8軟件得出葛葉總黃酮提取最優(yōu)條件為乙醇濃度84.4%，液料比48.4∶1，超聲溫度73.4 ℃，超聲時(shí)間92.8 min。為適合試驗(yàn)操作，調(diào)整為乙醇濃度85%，液料比48∶1，超聲溫度73 ℃，超聲時(shí)間90 min。重復(fù)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，平均提取量為26.38 mg/g，達(dá)到預(yù)測(cè)提取量（27.54 mg/g）的95.8%，說明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的葛葉總黃酮超聲輔助提取工藝參數(shù)可靠，具有一定參考價(jià)值，且葛葉黃酮類物質(zhì)含量較高。

2.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

葛葉總黃酮抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，所選7種常見致病菌的MIC為4～32 mg/mL，MBC為4～64 mg/mL，整體抑菌作用較強(qiáng)，尤其是對(duì)鼠傷寒沙門氏菌和化膿性鏈球菌抑制作用最強(qiáng)，且具有廣譜性。

2.4 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

通過在波長(zhǎng)210、517、734 nm下測(cè)定得到的吸光度及相關(guān)計(jì)算，得到葛葉總黃酮及同濃度抗壞血酸和葛根素分別對(duì)OH-、DPPH和ABTS自由基的清除率，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，葛葉總黃酮雖然比抗壞血酸的抗氧化活性弱，但是比葛根素強(qiáng)，且清除能力隨總黃酮含量增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。OH-、DPPH和ABTS自由基清除試驗(yàn)IC50分別為1.78、1.58和0.86 mg/mL，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化作用。

3 討論與結(jié)論

聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織預(yù)言，21世紀(jì)葛將成為繼水稻、小麥、玉米、馬鈴薯、甘薯之后的第六大主食[15-16]，而且葛的種植投資少、見效快、風(fēng)險(xiǎn)小、效益高，加之病蟲害較少一般不施農(nóng)藥，是較為理想的綠色食品，符合當(dāng)今推崇保健的潮流[17]。因此，葛資源的深度種植和開發(fā)利用日益受到重視。葛的生長(zhǎng)期需要掐苗5～6次，產(chǎn)量極其可觀，而葛葉中含有較多活性物質(zhì)，具有廣闊的開發(fā)研究前景。

該研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)葛葉總黃酮的超聲輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件為乙醇濃度85%，液料比48∶1，超聲溫度73 ℃，超聲時(shí)間90 min，在該條件下，葛葉總黃酮提取量為26.38 mg/g，與模型預(yù)測(cè)的提取量誤差較小，說明利用響應(yīng)面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。吳超等[1]采用正交試驗(yàn)對(duì)葛葉總黃酮的熱水浸泡提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，其最佳工藝為提取溫度80～100℃，時(shí)間為30～40min，溶劑體積為50～60mL，該條件下，總黃酮提取率為1.18%（相當(dāng)于提取量11.8 mg/g），遠(yuǎn)低于該試驗(yàn)，其原因除與葛葉的產(chǎn)地、品種及采摘季節(jié)等有關(guān)外，最主要原因是超聲輔助提取的工藝條件不同所致，超聲波能增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，提高藥物成分溶出速度和溶出數(shù)量[18]，這說明響應(yīng)面法結(jié)合超聲輔助提取工藝是一種更好的優(yōu)化方法。

該研究葛葉中總黃酮含量較高，且表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性和抗氧化活性，說明在產(chǎn)量及活性方面葛葉黃酮都具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值，可為深入研究葛葉黃酮化合物及提高葛資源綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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