產(chǎn)油微藻脅迫培養(yǎng)策略研究綜述

聶煜東,耿媛媛,張賢明,蔣光明 (.重慶工商大學(xué),廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心,重慶 400067；2.重慶理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400054；3.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境水質(zhì)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 00085)

為應(yīng)對(duì)全球變暖等環(huán)境惡化問(wèn)題并解決能源需求,開(kāi)發(fā)可再生,環(huán)境友好型替代能源進(jìn)而實(shí)現(xiàn)能源多元化成為人們的共識(shí)[1].當(dāng)前,以生物柴油為代表的生物質(zhì)能源越來(lái)越受到人們的關(guān)注.基于不同的原料來(lái)源,生物柴油的發(fā)展可劃分為三代.以玉米,大豆等農(nóng)作物為原料轉(zhuǎn)化的生物柴油屬于第一代生物質(zhì)能源,但其不僅直接消耗糧食,同時(shí)會(huì)由于占用耕地而間接影響糧食產(chǎn)量[2-3].

以油棕,麻風(fēng)樹(shù)等非糧食類(lèi)油料植物制備的生物柴油屬于第二代生物質(zhì)能源,其對(duì)耕地?zé)o直接影響,且對(duì)環(huán)境的影響小,但轉(zhuǎn)化率低,經(jīng)濟(jì)可行性差制約了其發(fā)展[4].以微藻衍生的生物柴油屬于第三代生物質(zhì)能源,目前已應(yīng)用于航空燃料[5].與玉米,大豆,油棕等相比,微藻光合效率更高,因而在生物量,油脂和生物柴油產(chǎn)率方面更具潛在優(yōu)勢(shì)[6];微藻生物柴油相比普通柴油而言,氧,硫含量低,燃燒時(shí)產(chǎn)生的一氧化碳和硫化物較少,并且無(wú)芳香烴污染;此外,微藻作為生物柴油的原料,能夠有效減少用于糧食生產(chǎn)的耕地壓力[7-8].因此,微藻生物柴油被認(rèn)為是極具潛力的環(huán)保型化石燃料替代能源.

然而,當(dāng)前微藻產(chǎn)油成本仍然不能滿足微藻生物柴油的大規(guī)模商業(yè)推廣,其中微藻油脂產(chǎn)率是影響產(chǎn)油成本的關(guān)鍵因素之一,其主要取決于微藻種類(lèi)及其培養(yǎng)環(huán)境[9-10].從藻種方面看,小球藻,柵藻,布朗葡萄藻,三角褐藻等被認(rèn)為是最具產(chǎn)油潛力的能源微藻(表 1),然而常規(guī)培養(yǎng)下其油脂產(chǎn)率仍然不能滿足需求[11].構(gòu)建基因工程藻種提高其產(chǎn)油能力固然是一種選擇,但適合用于改造的藻種不多,相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制未完全明確,且缺乏具體的生物學(xué)工具(如有效的核轉(zhuǎn)變,啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記以及轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達(dá)等)[12];此外,基因工程藻種在使用過(guò)程中存在一定生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).因此,通過(guò)控制培養(yǎng)環(huán)境促進(jìn)微藻油脂合成成為提高微藻油脂產(chǎn)率,降低微藻生物柴油成本的有效途徑之一[13].例如,提高或降低培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素含量,被證明有助于微藻油脂積累[14-15];提高或降低光強(qiáng),升高或降低溫度,改變培養(yǎng)環(huán)境的pH值,提高鹽度等手段也常被用來(lái)誘導(dǎo)微藻油脂積累[16-18].這類(lèi)改變培養(yǎng)條件的手段通常會(huì)對(duì)微藻生長(zhǎng)造成脅迫,一定程度上刺激了胞內(nèi)油脂合成.這些脅迫主要可分為三類(lèi),包括以改變碳氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素為代表的營(yíng)養(yǎng)脅迫,以改變溫度,光照,pH值等為代表的環(huán)境脅迫,以及以不同脅迫方式耦合而來(lái)的聯(lián)合脅迫.本文從影響產(chǎn)油微藻生長(zhǎng)的主要因素出發(fā),對(duì)相關(guān)脅迫培養(yǎng)策略進(jìn)行了綜述,并對(duì)微藻脅迫培養(yǎng)促進(jìn)生物油脂合成的機(jī)理進(jìn)行了概述;最后結(jié)合實(shí)際案例,對(duì)未來(lái)微藻脅迫產(chǎn)油的策略選擇進(jìn)行了建議和展望.

表1 常見(jiàn)淡水和海水微藻的油脂含量[19-20]Table 1 The lipid content of the normal freshwater and seawater microalgae

續(xù)表1

1 主要脅迫培養(yǎng)手段

當(dāng)前,大部分微藻的油脂產(chǎn)率仍不夠理想,為進(jìn)一步提高微藻的產(chǎn)油能力,根據(jù)影響微藻生長(zhǎng)和產(chǎn)油的因素,相應(yīng)的開(kāi)發(fā)出了包括營(yíng)養(yǎng)脅迫,環(huán)境脅迫及營(yíng)養(yǎng)-環(huán)境聯(lián)合脅迫等微藻脅迫培養(yǎng)手段(表2).

表2 各種脅迫培養(yǎng)手段特點(diǎn)Table 2 Features of the diverse stress cultivaton methods

續(xù)表2

續(xù)表2

2 營(yíng)養(yǎng)脅迫

微藻生長(zhǎng)及其油脂組成與培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分密切相關(guān),培養(yǎng)基中碳,氮,磷等營(yíng)養(yǎng)元素的脅迫作用,會(huì)直接影響藻細(xì)胞的代謝過(guò)程,從而讓更多的物質(zhì)和能量進(jìn)入油脂代謝,促使微藻油脂快速積累.雖然營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)不同藻種的脅迫效果有所差異,但其總體來(lái)說(shuō)仍被認(rèn)為是促進(jìn)微藻油脂積累最常用和有效的方法之一,且營(yíng)養(yǎng)脅迫不僅會(huì)影響油脂的產(chǎn)量,還會(huì)調(diào)節(jié)極性脂質(zhì)和非極性脂質(zhì)的相對(duì)比例,因此其對(duì)油脂的量和質(zhì)有同步影響.

2.1 碳脅迫

碳是構(gòu)成微藻細(xì)胞的基本元素之一,在藻細(xì)胞的光合作用和呼吸代謝兩個(gè)過(guò)程中起至關(guān)重要的作用.碳源主要分為無(wú)機(jī)碳源(CO2,HCO3-,CO32-等)和有機(jī)碳源(葡萄糖,乙酸,甘油等)兩大類(lèi),其很大程度上影響著微藻脂肪酸的組成和代謝.CO2對(duì)微藻生長(zhǎng)及油脂積累有十分重要的作用.郭琪等[69]利用 5% vol CO2,10% vol CO2培養(yǎng)兩株?yáng)旁?結(jié)果表明 10% vol CO2濃度使柵藻FACHB-1545和柵藻FACHB-1600培養(yǎng)18d后最大生物量分別是空氣組的2.3倍和1.6倍,最大油脂產(chǎn)率是空氣組的1.48和1.26倍.部分微藻如小球藻,微擬球藻等可利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)或兼性培養(yǎng),如Patidar等通過(guò)外加5g/L葡萄糖,20g/L果糖,獲得最大油脂含量,分別為 39.06%,26.71%[70],但有機(jī)碳源的價(jià)格使得該方法推廣受到限制.近些年來(lái),為解決有機(jī)碳源脅迫產(chǎn)油成本問(wèn)題,以廢水中的有機(jī)物(糖類(lèi),淀粉,乙酸鹽)作為微藻碳源受到研究人員的廣泛關(guān)注.劉香華等[27]考察了 3種碳源(葡萄糖,NaHCO3,乙酸鈉)對(duì)小球藻生長(zhǎng)和產(chǎn)油的脅迫影響,研究結(jié)果表明葡萄糖相對(duì)于其它兩種無(wú)機(jī)碳源更能促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)和油脂積累.綜上,控制碳源含量和形態(tài)是碳脅迫微藻生長(zhǎng)和產(chǎn)油的重要途徑.

碳脅迫條件下微藻油脂積累的主要機(jī)制如圖 1所示,在 15% vol CO2的脅迫下,丙酮酸脫氫酶(PDHC)和乙酰輔酶a羧化酶(ACC)相關(guān)的基因表達(dá)均增加,丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)而由乙酰輔酶 a通向丙二酰輔酶 a的通路增強(qiáng);中間代謝物丙酮酸鹽能更多地流向了丙二酰輔酶a和丙二酰載體蛋白,并與較短的碳鏈反應(yīng)生成較長(zhǎng)的碳鏈,強(qiáng)化了脂肪酸的合成通路.此外,碳脅迫下催化第一步碳鏈加氫反應(yīng)的 3-酮脂?；d體蛋白還原酶的基因上調(diào),增強(qiáng)了脂肪酸的氫化過(guò)程,使脂肪酸的不飽和度下降,其與碳鏈加長(zhǎng)過(guò)程的增強(qiáng)共同促進(jìn)整個(gè)脂肪酸的合成代謝,最終提高了藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量,同時(shí)也改變了油脂的成分[22].

圖1 碳脅迫下藻細(xì)胞油脂積累的代謝途徑[22,71]Fig.1 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under carbon stress

綜上所述,在高碳脅迫條件下,藻細(xì)胞內(nèi)油脂代謝途徑會(huì)發(fā)生變化,進(jìn)而誘導(dǎo)藻細(xì)胞積累更多油脂.基于提高微藻油脂產(chǎn)率的目的,可通過(guò)控制碳源形態(tài)和含量,并結(jié)合藻細(xì)胞光合活性和油脂代謝途徑的相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控來(lái)進(jìn)一步強(qiáng)化高碳脅迫對(duì)微藻生長(zhǎng)和油脂積累的促進(jìn)作用.

2.2 氮脅迫

氮是微藻合成葉綠素,生物大分子如蛋白質(zhì),核酸及含氮脂質(zhì)等物質(zhì)的基本元素,是微藻細(xì)胞生長(zhǎng)最重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一.此外,對(duì)于諸多微藻物種,脂質(zhì)含量與氮源濃度之間存在線性關(guān)系.例如,蘇怡等[31]通過(guò)分別控制 NaNO3,NH4HCO3,(NH2)2CO 的濃度為 18,9,6,3mmol四個(gè)梯度對(duì)真眼點(diǎn)藻屬,魏氏藻屬,眼點(diǎn)擬微綠球藻進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)氮濃度與油脂含量具有顯著相關(guān)性.這是由于氮脅迫能夠影響藻細(xì)胞的其他代謝途徑,進(jìn)而間接影響微藻脂質(zhì)代謝.相關(guān)研究表明真核微藻光合固碳量的 40%與氮素經(jīng)三羧酸循環(huán)共同合成蛋白質(zhì),然而在氮缺乏條件下,三羧酸循環(huán)代謝速率下降,從而促使本應(yīng)進(jìn)入三羧酸循環(huán)的碳源轉(zhuǎn)而流向脂肪酸代謝[72-73].進(jìn)一步的工作表明,微藻對(duì)不同氮源的利用能力存在差異,例如 NH4Cl為氮源的中肋骨條藻生長(zhǎng)和產(chǎn)油情況優(yōu)于NaNO3和尿素[74].因此,缺氮或氮源形態(tài)的控制均能夠影響微藻的生長(zhǎng)及油脂積累.

氮脅迫條件下微藻油脂積累的主要機(jī)制如圖 2所示.一方面,氮脅迫降低了蛋白質(zhì)對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng),更多碳源進(jìn)入了卡爾文循環(huán),為后續(xù)甘油三酯和脂肪酸積累奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[75];另一方面,細(xì)胞內(nèi)源性含氮化合物如蛋白質(zhì)或葉綠素降解,為油脂代謝提供了碳源和能量[76].在缺氮條件下,參與脂質(zhì)積累的相關(guān)代謝酶的表達(dá)會(huì)上調(diào),如與催化脂肪酸合成密切相關(guān)的乙酰輔酶a,以及甘油三酯合成相關(guān)的幾種酶,如甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT),甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶(DAGAT),磷脂酸磷酸酯酶(PAP),溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)等,這些酶活性的變化進(jìn)一步促進(jìn)了碳源向油脂的轉(zhuǎn)化[77].

圖2 氮脅迫下藻細(xì)胞油脂積累的代謝途徑[75-77]Fig.2 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under nitrogen stress

總體來(lái)說(shuō),在氮脅迫條件下,微藻油脂含量顯著增加,其主要原因是在氮脅迫條件下細(xì)胞內(nèi)碳源的重新分配,促使本該流向蛋白質(zhì)合成的碳源轉(zhuǎn)而流向油脂合成.因此,在使用氮脅迫的過(guò)程中,可通過(guò)調(diào)整氮的含量和形態(tài)來(lái)營(yíng)造合適的缺氮環(huán)境,同時(shí)結(jié)合碳源的供給,將更多的碳源引導(dǎo)至油脂代謝.

2.3 磷脅迫

磷是影響微藻生長(zhǎng)和產(chǎn)油的主要營(yíng)養(yǎng)元素之一,是構(gòu)成磷脂,DNA,RNA,ATP等的必要元素,參與微藻的細(xì)胞分裂,物質(zhì)合成,能量傳遞及信號(hào)傳導(dǎo)等各種代謝活動(dòng)[20].磷主要分為無(wú)機(jī)磷(PO43-,HPO42-等)和有機(jī)磷(ATP,2-磷-甘油酸等)兩類(lèi).研究表明,磷濃度及其形態(tài)對(duì)微藻脂質(zhì)含量有一定影響[78]. Mandal等[79]在磷濃度為0.06～0.1g/L的情況下培養(yǎng)柵藻,油脂含量從 29.5%下降至 10%,Arora[35]和 Chu等[36]通過(guò)對(duì)小球藻無(wú)磷限制培養(yǎng)也得到相似的結(jié)果.然而,Reitan等[39]將微擬球藻和扁球藻在磷濃度為 0.05～0.09mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)油脂含量均有所降低.因此,對(duì)于不同藻種,磷脅迫對(duì)其產(chǎn)油效果的影響各不相同,采用磷脅迫時(shí),除需要優(yōu)化磷的形態(tài)和濃度外,還需針對(duì)性的選擇合適藻種.

磷脅迫條件下藻細(xì)胞油脂積累的機(jī)制如圖3所示,磷酸鹽通過(guò)淀粉分支酶(SBE)和淀粉酶(DIS)的活性進(jìn)而影響淀粉和油脂合成途徑之間的碳流流向[80].淀粉合成與脂質(zhì)合成具有共同的碳前體(甘油-3-磷酸鹽),通過(guò)磷脅迫降低 3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD),醛縮酶(ALD)等關(guān)鍵酶活性從而阻斷淀粉合成途徑,可以增加脂質(zhì)積累的代謝通量.同時(shí),參與編譯DAGAT和丙酮酸激酶的基因會(huì)上調(diào),進(jìn)而進(jìn)一步促進(jìn)了葡萄糖向油脂的轉(zhuǎn)化[81].

圖3 磷脅迫下藻細(xì)胞的油脂代謝途徑[71,80-81]Fig.3 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under phosphorus stress

綜上所述,缺磷脅迫對(duì)微藻油脂合成具有促進(jìn)作用,但同時(shí)也存在藻種在磷缺乏時(shí)含油量下降的情況,因此不同藻種在磷脅迫下其產(chǎn)油特征具有一定差異性.在采用缺磷脅迫培養(yǎng)微藻時(shí)首先要選擇合適的藻種,同時(shí)要考慮到磷形態(tài)對(duì)微藻的影響.此外,由于磷脅迫培養(yǎng)下微藻油脂積累主要是通過(guò)抑制淀粉合成相關(guān)酶的活性,從而使更多的碳流向油脂代謝而來(lái),因此缺磷脅迫中適當(dāng)提高碳源供給,能夠進(jìn)一步促進(jìn)油脂的合成.

3 環(huán)境脅迫

環(huán)境因素在影響微藻生長(zhǎng)的同時(shí),也影響微藻的代謝過(guò)程,從而導(dǎo)致包括油脂在內(nèi)的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量變化.

3.1 光脅迫

光照是微藻生長(zhǎng)和代謝的能量來(lái)源,是影響其生長(zhǎng)速率和油脂積累最主要的因素之一.其中,光照強(qiáng)度,光暗周期,光照波長(zhǎng)是調(diào)控光照的三個(gè)主要方向.光照強(qiáng)度主要影響微藻的光合電子傳遞鏈,一定范圍內(nèi),隨著光強(qiáng)的增加,藻細(xì)胞的生物量也增加,當(dāng)光照強(qiáng)度超過(guò)一定范圍時(shí),則會(huì)抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng),甚至導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡[17].光照強(qiáng)度對(duì)微藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量的影響與微藻藻種有關(guān).如小球藻在 200μmol/(m2·s)脅迫下能獲得最大生物量,在 400μmol/(m2·s)脅迫下生物量受到抑制,油脂含量顯著增加[82],但微擬球藻在低光強(qiáng) 2000Lux脅迫下會(huì)誘導(dǎo)油脂積累,在高光強(qiáng)10000Lux脅迫下生物量增加了2.8倍[83].光暗周期同樣會(huì)對(duì)微藻生物量和油脂含量產(chǎn)生影響,Ahmad等通過(guò)對(duì)不同光照下柵藻進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)12:12(光:暗)下的生物量最大,24:0(光:暗)下生物量最低[41].然而,Wahidin等[84]分別將微擬球藻在12:12(光:暗),18:6(光:暗)和 24:0(光:暗)下培養(yǎng)時(shí),在18:6(光:暗)下時(shí)可以獲得最大的生物量和油脂含量,因此光暗周期對(duì)微藻產(chǎn)油的脅迫影響也是因藻種而異.尹繼龍等[42]發(fā)現(xiàn)光照波長(zhǎng)也會(huì)對(duì)微藻生長(zhǎng)和產(chǎn)油有著顯著的影響,小球藻在藍(lán)光脅迫下油脂含量最高, Das等[85]也得到了相似的結(jié)果.總之,通過(guò)光照影響微藻生長(zhǎng)及產(chǎn)油時(shí),可同時(shí)通過(guò)光強(qiáng),光暗比以及光質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié).

光照脅迫影響油脂合成的主要機(jī)理如圖4所示.在微藻的可耐受范圍內(nèi),高光強(qiáng)通過(guò)提升光合作用促進(jìn)微藻生長(zhǎng),同時(shí)通過(guò)提高 GPAT,LPAAT,DAGAT等活性促進(jìn)甘油三酯的合成,通過(guò)促進(jìn)糖酵解,檸檬酸鹽循環(huán)等增加了乙酰輔酶 a的表達(dá),進(jìn)而在丙二酰輔酶 a等的催化下進(jìn)行脂肪酸的大量合成[86].脂肪酸的生物合成需要三磷酸腺苷(ATP)和還原型氫(NADPH),糖酵解和磷酸戊糖這兩種途徑為脂肪酸的生物合成提供ATP和NADPH.Wang等[87]研究表明在高光照脅迫條件下,糖酵解和磷酸戊糖這兩種途徑的表達(dá)會(huì)上調(diào),因此促進(jìn)了脂肪酸的合成.Wang等[87]同時(shí)研究了低光照脅迫對(duì)微藻產(chǎn)油的影響,低光照脅迫對(duì)脂肪酸的合成同樣具有一定促進(jìn)作用,低光照脅迫下,糖酵解,卡爾文循環(huán),三羧酸循環(huán)等碳循環(huán)會(huì)產(chǎn)生更多的乙酰輔酶 a,同時(shí)對(duì)丙二酰輔酶 a等脂肪酸合成關(guān)鍵酶活性具有一定促進(jìn)作用,因此有效地促進(jìn)了脂肪酸的合成.

圖4 光脅迫下藻細(xì)胞的油脂代謝途徑[86,88]Fig.4 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under light stress

實(shí)際上,每種藻對(duì)光照的需求各異,光照強(qiáng)度,光照周期,光質(zhì)等脅迫對(duì)微藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響效果還與藻種有關(guān),因此在光脅迫時(shí)需要選擇與其相適應(yīng)的藻種.光脅迫對(duì)微藻油脂積累的影響主要通過(guò)調(diào)節(jié)其光合作用來(lái)實(shí)現(xiàn),這涉及到過(guò)程中的一系列物質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞器間的物質(zhì)轉(zhuǎn)移過(guò)程[86],進(jìn)一步找到光脅迫過(guò)程中調(diào)控光合作用的關(guān)鍵點(diǎn),對(duì)于開(kāi)發(fā)相應(yīng)的光脅迫輔助措施從而促進(jìn)油脂的合成至關(guān)重要.

3.2 溫度脅迫

溫度是影響微藻生長(zhǎng)和油脂合成的重要因素之一.一般情況下,微藻的最佳生長(zhǎng)溫度為20～30℃之間,在適宜溫度范圍之內(nèi),升高溫度可以促進(jìn)微藻光合作用相關(guān)酶的活性及功能,從而加快微藻生長(zhǎng),溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí),微藻生長(zhǎng)代謝率將急劇下降,從而導(dǎo)致微藻生物量的減少[88-89].微藻對(duì)溫度脅迫的應(yīng)激與細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性有很大相關(guān)性[90]. Richmond等[91]研究表明低溫脅迫下微藻為維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性以提高其對(duì)低溫的耐受性,會(huì)大量合成不飽和脂肪酸.類(lèi)似地,韓飛等[47]研究表明四尾柵藻在 40℃高溫脅迫下,迅速將藻細(xì)胞內(nèi)的多糖轉(zhuǎn)化為油脂,以此抵抗不利環(huán)境,進(jìn)而提高微藻自身的抗逆性.總之,溫度適宜時(shí)將有利于微藻的生物量增長(zhǎng),而溫度不利時(shí)將在一定程度上刺激油脂的合成.

溫度脅迫對(duì)微藻油脂積累的影響機(jī)理如圖5所示.其中,溶血磷脂酸的合成是胞內(nèi)油脂生物合成的關(guān)鍵步驟.在低溫脅迫下,催化甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化為溶血磷脂酸的GPAT增加,同時(shí)催化甘油二酯向單半乳糖甘油二酯,雙半乳糖甘油二酯及磷酯酰甘油等轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶如半乳糖甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶(MS)和磷脂酰甘油磷酸脂酶(PGPA)活性增加,使得極性脂及油脂含量增加[92].在高溫脅迫下,甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)和 DAGAT的表達(dá)增加,G3PDH能將二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸,其中,二羥丙酮磷酸是最終轉(zhuǎn)化為T(mén)AG或極性脂的第一步;與此同時(shí),高溫脅迫下甘油三酯脂肪酶(ATGL)表達(dá)下調(diào),使得TAG轉(zhuǎn)化為甘油二酯的量減少,因此TAG和總酯含量增加[93].

圖5 溫度脅迫下藻細(xì)胞油脂積累代謝途徑[92-93]Fig.5 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under temperature stress

總的來(lái)說(shuō),高溫和低溫脅迫均能夠促進(jìn)微藻油脂的積累,高溫條件下偏向于合成 TAG,而低溫條件下更偏向于極性脂的合成.因此,在應(yīng)用溫度脅迫調(diào)控微藻油脂合成時(shí),不但能夠控制微藻油脂的量,還能夠影響微藻油脂的質(zhì),這是溫度脅迫較其他脅迫獨(dú)有的特點(diǎn).在實(shí)際工藝中合理利用溫度脅迫的這個(gè)特點(diǎn),有助于生物柴油最終品質(zhì)的提升.

3.3 pH值脅迫

環(huán)境pH值同樣是影響微藻生長(zhǎng)代謝的重要因素之一.Peng等[52]研究表明南極冰藻在 pH值為7.5～9.5的范圍內(nèi),pH值的增加會(huì)促進(jìn)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和油脂的積累.Gardne等[53]認(rèn)為不同藻種具有不同的最適pH值.例如南極冰藻等在較高的pH值下可以積累更多的油脂[52],而柵藻在pH值超過(guò)6時(shí),脂質(zhì)含量會(huì)隨 pH 值的增加而下降[94].因此,選擇與藻種相適宜的pH值范圍對(duì)于微藻油脂積累十分重要.

pH值脅迫對(duì)微藻生長(zhǎng)及油脂積累的影響機(jī)理主要包括兩個(gè)方面.首先,pH值對(duì)環(huán)境中各元素的形態(tài)有著直接的影響.例如水樣中碳形態(tài)的分布受 pH值的直接影響,而碳的形態(tài)又進(jìn)一步影響著微藻的生長(zhǎng)和油脂積累[95];pH值還會(huì)對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)元素的形態(tài)具有調(diào)控作用,如磷酸鹽,鐵和銨等,這同樣影響微藻的生長(zhǎng)和產(chǎn)油[96-97].其次,pH值對(duì)微藻細(xì)胞的增殖和分化有著重要影響.Bartley等[98]研究表明高pH值脅迫能夠誘導(dǎo)細(xì)胞從增殖階段轉(zhuǎn)換至生物質(zhì)生產(chǎn)階段.即在該脅迫條件下,藻細(xì)胞會(huì)將部分細(xì)胞增殖分裂的能量轉(zhuǎn)化到胞內(nèi) TAG合成代謝中.堿性 pH值脅迫下微藻的油脂積累主要是由于藻細(xì)胞分裂減緩,因此微藻在該pH值條件下通過(guò)犧牲細(xì)胞密度及膜脂含量,促進(jìn)了胞內(nèi)TAG的積累[99].

總而言之,在利用 pH 值脅迫微藻產(chǎn)油時(shí),首先要根據(jù)藻種來(lái)選擇合適的脅迫 pH值;其次要將 pH值與碳氮磷等元素的形態(tài)變化聯(lián)系起來(lái),從而更好地促進(jìn)微藻生物量和油脂產(chǎn)率;最后要注意pH值對(duì)微藻的生理影響,在實(shí)際調(diào)控pH值時(shí)注意將其維持在一個(gè)合理范圍內(nèi).

3.4 鹽度脅迫

鹽度是影響微藻生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物積累的重要因素之一.有研究表明鹽脅迫使螺旋藻細(xì)胞對(duì)強(qiáng)光的敏感性增強(qiáng),會(huì)導(dǎo)致其光合放氧能力顯著下降[100].類(lèi)似地,魚(yú)腥藻的凈光合放氧速率和呼吸速率隨NaCl濃度的升高而降低,使得魚(yú)腥藻的生長(zhǎng)被抑制[101].另一方面,有研究表明高鹽度雖會(huì)抑制生物量,但卻能促進(jìn)藻細(xì)胞大量積累油脂.Miyasaka等[102]的研究表明萊茵衣藻HS-5在高鹽濃度下會(huì)積累大量的油脂,同樣Ben-Amotz等[103]的研究表明鹽脅迫下的杜氏鹽藻細(xì)胞會(huì)大量合成甘油,且胞內(nèi)甘油含量與外部鹽濃度成正相關(guān).

鹽脅迫對(duì)微藻產(chǎn)油的影響機(jī)理如圖 6所示,其被認(rèn)為是微藻細(xì)胞內(nèi)碳流由淀粉向脂類(lèi)轉(zhuǎn)變的重要調(diào)節(jié)因素之一.微藻在鹽脅迫條件下會(huì)產(chǎn)生一些代謝物質(zhì)以保護(hù)自身不受鹽分傷害,同時(shí)維持自身與外界的滲透壓平衡,因此在鹽脅迫條件下,油脂含量增加,淀粉的含量則降低[104].有研究發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下與油脂合成相關(guān)的關(guān)鍵物質(zhì)乙酰輔酶a上調(diào),而與淀粉合成相關(guān)的關(guān)鍵酶焦磷酸化酶表達(dá)下調(diào),與此同時(shí),鹽脅迫下 DIS的活性上升,使得胞內(nèi)淀粉更快的分解為葡萄糖,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為果糖 1,6-二磷酸和二羥基丙酮磷酸,在G3PDH和DAGAT的作用下,依次轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸和溶血磷脂酸;甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油后成為T(mén)AG的前體物,而溶血磷脂酸經(jīng)過(guò)Kennedy代謝后同樣轉(zhuǎn)化為T(mén)AG[105-107].由于鹽脅迫下G3PDH和DAGAT的活性也會(huì)上升,因此油脂得到進(jìn)一步積累.

圖6 鹽脅迫下油脂積累代謝途徑[104-107]Fig.6 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under salt stress

鹽脅迫的成本較低且操作簡(jiǎn)便,但在使用時(shí)需注意將鹽濃度控制在合理范圍內(nèi).低濃度鹽脅迫下生物量較高,但油脂積累不明顯;高濃度鹽脅迫下微藻胞內(nèi)的油脂合成將得到大幅提升,但生物量會(huì)受到一定抑制;而鹽濃度一旦超過(guò)了微藻的耐受性,將可能導(dǎo)致微藻的生物量大幅下降甚至死亡.此外,由于不同微藻對(duì)鹽的耐受性不同,因此在實(shí)際操作時(shí)需根據(jù)藻種相應(yīng)的選擇其鹽濃度范圍.

4 其他脅迫

除碳,氮,磷等營(yíng)養(yǎng)脅迫以及光,溫度,pH 值,鹽度等環(huán)境脅迫外,近年來(lái),各種天然或人工合成的外源分子脅迫也引起了廣泛關(guān)注,例如阻斷劑,固定劑等.

阻斷劑主要指的是能夠抑制微藻胞內(nèi)代謝過(guò)程的物質(zhì),通過(guò)抑制部分代謝能夠讓更多的碳源及能量流向油脂代謝,從而獲得更高的油脂產(chǎn)率.研究表明,丁苯嗎啉,布雷菲德菌素 A,疊氮化物等均屬于這類(lèi)物質(zhì),其能夠影響微藻細(xì)胞內(nèi)基本功能代謝,進(jìn)而誘導(dǎo)甘油三酯大量積累.例如,Kim 等[60-61]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中分別添加丁苯嗎啉和布雷菲德菌素A,經(jīng)過(guò)丁苯嗎啉處理1h后的萊茵衣藻細(xì)胞TAG含量至少是未添加組的 4倍,添加了布雷菲德菌素 A的培養(yǎng)基中 TAG含量是未添加對(duì)照組的 1.3倍.Zalogin等[62]研究表明20μmol/L的疊氮化鈉會(huì)抑制藻細(xì)胞硝酸鹽還原酶的產(chǎn)生,影響微藻對(duì)氮的利用,形成胞內(nèi)的缺氮環(huán)境,從而增加藻細(xì)胞油脂的合成.阻斷劑的最大特點(diǎn)是見(jiàn)效較快,且由于投加量較小,因此成本較低;但在實(shí)際使用過(guò)程中要注意其毒性的影響,避免二次污染.

固定劑是一類(lèi)能夠與二氧化碳等微藻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合,并加快營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被微藻利用的小分子物質(zhì).如氫氧化鈉,一乙醇胺(MEA),二乙醇胺(DEA)等均可強(qiáng)化微藻固碳進(jìn)而促進(jìn)微藻生長(zhǎng)和油脂積累.Rosa等[63]在培養(yǎng)基中周期性的添加 50mg/LMEA,油脂含量和蛋白質(zhì)含量分別增加了30.8%和44%.Sun等[64]探索MEA對(duì)微藻生長(zhǎng)及代謝的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)當(dāng)MEA濃度從0增加至100mg/L時(shí),生物質(zhì)較常規(guī)培養(yǎng)提高了 16.7%,但當(dāng) MEA濃度增加至150mg/L時(shí),微藻生長(zhǎng)和胞內(nèi)代謝活動(dòng)均受到抑制.醇胺類(lèi)固定劑在實(shí)際使用時(shí)濃度不能過(guò)高,否則會(huì)生成具有毒性的中間體氨基甲酸鹽,對(duì)微藻生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用;同時(shí)過(guò)高濃度的醇胺對(duì)設(shè)備具有嚴(yán)重腐蝕作用.此外,固定劑在實(shí)際使用中也具一定的局限性,如該類(lèi)物質(zhì)具有明顯的時(shí)效性,固碳效果隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,因此在實(shí)際使用中需要注意及時(shí)補(bǔ)充固定劑.

除上述兩類(lèi)外源分子外,隨著研究人員對(duì)該領(lǐng)域研究的深入,更多的脅迫物質(zhì),手段及思路被發(fā)現(xiàn)或提出.例如 Taoka等[65]在培養(yǎng)基中添加表明活性劑如吐溫 80,通過(guò)影響細(xì)胞膜通透性使更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi),結(jié)果表明 1%的吐溫 80使生物量提高了1.89倍,多不飽和脂肪酸含量增加了37%.李大菲等[66]在脅迫條件下添加抗氧化劑褪黑素用以消除脅迫過(guò)程中產(chǎn)生的氧化損傷,結(jié)果顯示在 1,10和100 μmol/L的褪黑素投加量下,藻細(xì)胞中性油脂含量分別比對(duì)照組提高1.32,1.24,1.16倍.總而言之,上述諸多手段為微藻脅迫產(chǎn)油提供了除營(yíng)養(yǎng)脅迫和環(huán)境脅迫外的更多選擇.

5 聯(lián)合脅迫

以上各類(lèi)脅迫在特定環(huán)境條件下應(yīng)用于誘導(dǎo)微藻脂質(zhì)合成時(shí),均取得了較好效果.目前,在當(dāng)前國(guó)內(nèi)外不多的微藻生物柴油應(yīng)用案例中,也大多采取突出單一脅迫效果的策略,例如荷蘭 Algae Link公司通過(guò)新型光生物反應(yīng)系統(tǒng)控制微藻生長(zhǎng)的光學(xué)條件,以此促進(jìn)產(chǎn)油微藻的生長(zhǎng)及產(chǎn)油代謝;以色列錫姆公司利用廢棄中的高濃二氧化碳促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)和產(chǎn)油;我國(guó)的新奧科技在內(nèi)蒙采用煤化工高純二氧化碳尾氣培養(yǎng)微藻,降低了能源微藻培養(yǎng)成本并促進(jìn)了微藻油脂積累[108].然而,上述單一脅迫手段雖對(duì)微藻油脂含量或油脂產(chǎn)率具有明顯效果,但油脂產(chǎn)率仍然不能滿足擴(kuò)大化生產(chǎn)的要求,項(xiàng)目離實(shí)現(xiàn)盈利尚有差距.多項(xiàng)研究表明,多種脅迫策略相結(jié)合將比單一脅迫更有利于微藻脂質(zhì)的生成[109].

Pal等[110]對(duì)微擬球藻進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),發(fā)現(xiàn)在氮源充足的培養(yǎng)環(huán)境下,添加40g/L氯化鈉同時(shí)增強(qiáng)光照至700 μmolm-2.s-1,甘油三酯含量較單一脅迫增加了25%.Kwak等[67]通過(guò)3株不同的萊茵衣藻,分別研究氮饑餓與高溫度脅迫,氮饑餓和鹽脅迫,高溫和鹽脅迫,高 pH值和鹽脅迫相結(jié)合的策略,研究結(jié)果表明不同策略之間的脅迫效果存在一定差異,但兩種不同條件的聯(lián)合脅迫均比單一脅迫更加明顯地促進(jìn)油脂的積累.因此,根據(jù)實(shí)際環(huán)境情況靈活選用脅迫方式,并采取多脅迫聯(lián)合的策略,可以達(dá)到最大限度提高微藻油脂產(chǎn)量的目的,從而降低微藻產(chǎn)油成本.

6 結(jié)論與建議

6.1 結(jié)論

綜上,各類(lèi)脅迫培養(yǎng)均能不同程度地提升藻細(xì)胞油脂產(chǎn)率,但使用特點(diǎn),方式及作用機(jī)理等各有差異.采用包括碳,氮,磷在內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)脅迫時(shí),可通過(guò)調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的形態(tài)和含量來(lái)控制效果,通過(guò)營(yíng)養(yǎng)的脅迫讓更多碳素流向油脂代謝,從而提高油脂的產(chǎn)率.采用光脅迫時(shí),可通過(guò)調(diào)節(jié)光強(qiáng),光照周期,光質(zhì)等影響其光合作用,進(jìn)一步影響一系列物質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞器間的物質(zhì)轉(zhuǎn)移,最終達(dá)到促進(jìn)油脂合成的目的.采用溫度脅迫時(shí),根據(jù)高低溫對(duì)油脂成分的不同影響,可調(diào)控微蘊(yùn)生物柴油的品質(zhì).而在采用 pH值脅迫培養(yǎng)微藻時(shí),需要與營(yíng)養(yǎng)鹽形態(tài)結(jié)合起來(lái)考慮,且要注意 pH值需維持在合理的范圍內(nèi).鹽脅迫與pH值脅迫類(lèi)似,需要根據(jù)藻種來(lái)選擇合理的鹽度范圍.

總而言之,無(wú)論是傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)脅迫和環(huán)境脅迫,還是各種新型的各類(lèi)脅迫手段,歸根結(jié)底是圍繞著物質(zhì)和代謝兩方面來(lái)進(jìn)行.因此,如何加大碳素供應(yīng),如何讓更多碳素流向油脂合成代謝,是微藻產(chǎn)油脅迫中的最關(guān)鍵問(wèn)題.

6.2 建議

針對(duì)未來(lái)微藻產(chǎn)油的相關(guān)研究以及實(shí)際應(yīng)用中的脅迫策略選擇,本文建議一是開(kāi)發(fā)和采用更高效率的新型脅迫培養(yǎng)手段;二是針對(duì)性的建立和采用多脅迫聯(lián)合的策略.通過(guò)這兩個(gè)方向的努力,進(jìn)一步提升微藻的產(chǎn)油效率,從而降低微藻生物柴油成本,最終實(shí)現(xiàn)微藻生物柴油的產(chǎn)業(yè)化.