單激發(fā)雙發(fā)射近紅外熒光碳量子點制備、熒光性能與細胞成像

湛志華，陳茺而，莫大幸，謝木標，薛茗月，*，韓國成，毛惠會，鐘菁青

(1. 嶺南師范學院 化學化工學院，廣東 湛江 524048；2. 桂林電子科技大學 生命與環(huán)境科學學院，廣西 桂林 541004)

1 引 言

碳量子點(CDs)是繼富勒烯、碳納米管、石墨烯之后最受關(guān)注的碳基納米材料。從2004年Xu等[1]通過電弧放電的方法第一次得到這種具有明亮熒光的納米粒子到2006年Sun等[2]以水蒸氣為載體激光燒蝕碳靶制得碳點、進行表面鈍化并首次提出碳量子點的概念以來，CDs因其形貌為小于10 nm的類球形結(jié)構(gòu)、有大的Stokes位移[3]、低毒性、生物相容性好[4]、制備簡單、熒光性能穩(wěn)定及易于表面修飾[5]等優(yōu)點，被廣泛應用于生物傳感[6-7]、光學成像[8-9]、藥物載送[10]、光催化[11-12]等領(lǐng)域。此外，碳點還具有光引發(fā)電子轉(zhuǎn)移的行為，其在光伏設(shè)備及光捕獲材料上也有潛在的應用價值[13]。

自碳點被發(fā)現(xiàn)以來，制備方法就一直不斷地豐富且向著綠色環(huán)保、安全高效、操作簡單等方向發(fā)展，主要分為自上而下法(Top-down)和自下而上法(Bottom-up)兩類。自上而下法包括：激光燒蝕法、電化學法、氧化石墨烯法、弧光放電法等，是由宏觀尺寸的碳經(jīng)過加工變?yōu)榧{米顆粒的方法，產(chǎn)物大多為混合物，需要一定的分離提純工序，合成效率較低。自下而上法有：水熱法、微波法、溶劑熱法、熱解法、激光化學反應法等，是將有機碳化合物分子合成為納米粒子，制備工藝簡單，有的甚至能一步合成碳點，且實驗設(shè)備要求低，適合大規(guī)模制備，是目前采用比較多的一種制備方法[14]。

目前報道的熒光碳點發(fā)光主要集中在藍綠光[9,14-15]，與生物體自身熒光背景相近，不利于其在細胞成像中應用。而紅光和近紅外光碳點的報道較少，且前軀體的選擇多為化學試劑，制備工藝繁瑣，熒光量子產(chǎn)率偏低[16-18]。因此，探索綠色天然物質(zhì)制備CDs的工藝，制備出高熒光產(chǎn)率的紅光或近紅外光碳點甚至更長波長的光，將有力推進碳點在生物醫(yī)學領(lǐng)域、水處理環(huán)境保護領(lǐng)域、量子點敏化太陽能電池、光催化合成化學品等眾多研究領(lǐng)域的應用。單發(fā)射探針不可避免地受到生物樣品不均、儀器激發(fā)光波動、探針濃度不均一等環(huán)境因素影響[19]，單激發(fā)雙發(fā)射的比率熒光分析方法能有效克服上述缺點。比率熒光傳感器可消除外界因素變化對測量信號強度的影響，例如比率熒光探針濃度、光源不穩(wěn)定和生物組織背景熒光等；也可以消除假陽性信號，例如光漂白、細胞膜厚度、探針在細胞內(nèi)或者不同細胞之間的差異造成的不均勻分布等引起的失真信號[20-22]。

基于此，本文以綠色生物質(zhì)高山榕樹葉為碳源，通過溶劑熱法一步合成了單激發(fā)雙發(fā)射近紅外比率型熒光CDs。采用TEM、XRD和FT-IR等手段對其粒徑大小及分布、形貌、表面官能團等進行了表征，并探討了CDs耐酸堿、光學、抗鹽以及細胞成像效果。

2 實 驗

2.1 碳量子點(CDs)合成

將洗凈的新鮮高山榕樹葉打碎，加入50 mL的無水乙醇和50 mL丙酮混合，浸泡提取30 min后，取上層清液25 mL放入聚四氟乙烯反應釜，于電烘箱中200 ℃加熱10 h。冷卻至室溫后10 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移至透析袋中避光透析2 h，得到合成的CDs，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，于4 ℃冰箱保存，實驗前用超純水稀釋。

2.2 實驗儀器

FluoroMax-4型熒光光譜儀(Horiba，F(xiàn)rance)用于熒光光譜測定；T9型紫外-可見分光光度計(普析，北京)用于紫外-可見吸收光譜測定；Philips Tecnai G2 F20 S-TWIN場發(fā)射透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM,PhilipS,Netherlands)用于CDs粒徑的測定；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Fisher Scientific，USA)用于CDs表面基團表征；X’pert Pro MPD X射線衍射儀(PANalytical，Netherlands)用于CDs形貌表征；Zeiss LSM710 共聚焦激光掃描顯微鏡系統(tǒng)(CLSM，Zeiss，Germany)用于細胞成像的測定。除細胞毒性實驗外，其他實驗CDs的濃度均為100 μg/mL。所有實驗均在室溫下完成。

3 結(jié)果與討論

3.1 CDs的表征

從CDs的透射電鏡(TEM)圖(圖2)可以看出，合成的CDs分散性好、粒徑較小、比較均勻(2.0～8.0 nm)，幾乎90%的CDs的粒徑集中在3.0～6.0 nm之間(圖2(c))。平均尺寸約為4.70 nm，粒徑小，有利于CDs進入細胞。圖2(b)為CDs的高分辨透射電鏡圖，晶格常數(shù)為0.32 nm，與石墨烯的(002)面一致。

圖1 CDs的合成路線及應用

圖2 CDs 的TEM 圖像(a)、高分辨TEM 圖像(b)及粒徑分布圖(c)。

為得到合成CDs的晶面常數(shù)，進行XRD表征得到圖3，CDs在2θ=22°處有一個較寬的衍射峰，表明得到的碳點中心為sp2雜化的無定型碳。

圖3 CDs的XRD圖

通過傅里葉紅外光譜儀對碳點表面基團進行檢測，結(jié)果如圖4。3 457 cm-1處的寬峰表示樣品

圖4 CDs的FT-IR圖

3.2 CDs的光學性質(zhì)

如圖5所示，所得的CDs在紫外和可見光區(qū)均有明顯的吸收，且在360 nm激發(fā)波長下發(fā)出紅色熒光。從熒光光譜可以看到該CDs的最大激發(fā)波長為410 nm，最大發(fā)射波長為466 nm和676 nm，表示合成的碳點具有單激發(fā)雙發(fā)射近紅外熒光特性，可構(gòu)建比率型熒光探針。

圖5 CDs的紫外吸收光譜和激發(fā)、發(fā)射熒光光譜。

以硫酸奎寧作為參比，在360 nm激發(fā)波長下，按照公式

(1)

計算得到該CDs熒光量子產(chǎn)率為26.31%。其中φx和φs分別表示待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，F(xiàn)x和Fs分別表示待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的

積分熒光強度，Ax和As分別表示待測物質(zhì)和參比物質(zhì)對該波長激發(fā)光的吸收強度。

圖6為不同激發(fā)波長下CDs的發(fā)射光譜，由圖中可知，隨著激發(fā)波長從360 nm增加到410 nm，466 nm處的最大發(fā)射峰稍有紅移，具有激發(fā)依賴性；676 nm處的發(fā)射峰位置不變，熒光強度逐漸增加。從3D圖(圖7)也可明顯看出，隨著激發(fā)波長增加，676 nm處的發(fā)射峰熒光強度逐漸增大。

圖6 不同激發(fā)波長下CDs的熒光發(fā)射光譜

圖7 不同激發(fā)、發(fā)射波長下CDs的3D熒光光譜圖。

3.3 CDs的穩(wěn)定性

3.3.1 pH的影響

CDs的熒光強度一定程度上受溶液酸堿度影響，可通過調(diào)節(jié)pH值來確定I466/I676對溶液酸堿度的敏感程度，由圖8可知pH的變化對CDs的熒光強度影響不大。CDs的pH效應可能是由于碳點上同時存在—COOH和酰胺，中性和酸性條件下分子間有氫鍵締合作用，碳點聚集導致熒光猝滅[23]。在pH=11時，由于羧基發(fā)生去質(zhì)子化反應帶上負電荷，使碳點間保持單分散而熒光強度增大。

圖8 不同pH值對CDs熒光強度的影響

3.3.2 抗光漂白性

410 nm紫外燈照射不同的時間測定CDs的發(fā)射熒光強度如圖9所示，從圖中可以看出CDs在466 nm處的發(fā)射峰熒光強度基本不發(fā)生變化，而在676 nm處熒光強度稍有降低，可能原因是酰胺受熱易發(fā)生水解。將4 ℃保存的該CDs每隔15 d測其熒光強度，如圖10 所示。同時，在37 ℃

圖9 410 nm紫外燈照射時間對CDs熒光強度的影響

圖10 不同存儲時間對CDs熒光強度的影響(4 ℃)

下保存，每隔1 d測其熒光強度，如圖11 所示。熒光強度均基本保持不變，表明CDs具有良好的抗光漂白性、優(yōu)秀的光學穩(wěn)定性，這些性質(zhì)均有利于CDs在細胞成像、靶向示蹤等生化分析方面的應用。

圖11 不同存儲時間對CDs熒光強度的影響(37 ℃)

3.3.3 CDs的抗鹽性

為考察CDs受共存分子和離子的干擾情況，在pH=4的條件下分別加入不同濃度的NaCl、KCl測定 466 nm和 676 nm 處的熒光值。實驗結(jié)果表明，I466/I676(如圖12(a)、(b))幾乎不發(fā)生改變，有利于碳點在生物傳感、細胞成像方面的應用。

圖12 不同濃度的KCl/NaCl對CDs熒光強度的影響(NaCl濃度分別為0，0.25，0.5，0.75，1.25，2，2.5 mol/L；KCl濃度分別為0，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5 mol/L)

3.4 細胞毒性與活細胞熒光成像

為了探討CDs的生物應用，本文進行了細胞毒性實驗，利用T24細胞株，通過CCK-8分析法測定了CDs的細胞毒性。如圖13所示，該碳納米

圖13 T24細胞與不同濃度CDs孵育24 h后的相對細胞活性

材料的濃度從100 μg/mL增加到500 μg/mL時，細胞的存活率從99%降低到92%，在很寬的濃度范圍內(nèi)細胞毒性均保持在90%以上，證明該CDs的細胞毒性很低并且具有良好的生物相容性，說明在活細胞成像領(lǐng)域具有巨大的應用潛力。這些也表明制備的CDs可以安全地應用于細胞實驗。

采用激光共聚焦顯微成像技術(shù)，比率熒光檢測活細胞成像，在 405 nm激發(fā)波長下，可以在藍光通道中看到細胞膜、細胞質(zhì)中發(fā)出藍色熒光，在紅光通道中看到細胞膜、細胞質(zhì)中有紅色熒光(圖14)，表明該 CDs 生物相容性好，對細胞、組織穿透能力強，可有效避免生物體內(nèi)的背景干擾。

圖14 CDs 和 T24 細胞共同孵育10 h后的CLSM成像圖。(a)藍光通道;(b)明場;(c)紅光通道;(d)疊加圖。

4 結(jié) 論

本文以綠色高山榕樹葉為原料，通過溶劑熱法一步合成單激發(fā)雙發(fā)射的近紅外碳基熒光納米傳感器。其優(yōu)勢在于：(1)以天然生物質(zhì)為原料，綠色環(huán)保、原料廉價易得、生物毒性低；(2)合成純化步驟簡單；(3)熒光量子產(chǎn)率高、發(fā)出近紅外熒光；(4)該碳點具有良好的水溶性、抗鹽、抗光漂白性；(5)生物相容性好，能有效避免生物體內(nèi)背景干擾。以上結(jié)果表明，所得CDs作為環(huán)境友好材料在生物傳感、光學成像等領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。

本文專家審稿意見及作者回復內(nèi)容的下載地址：http://cjl.lightpublishing.cn/thesisDetails#10.37188/CJL.20210157.