正北芪多糖對結(jié)腸炎小鼠的抗炎作用研究

鐘 敏，李昕宇，郝佳美，任建武

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

炎癥性腸病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）危害性強，治療周期長，近年來歐美國家的IBD發(fā)病率相對穩(wěn)定，而我國呈快速增長趨勢，預(yù)計2025年患病人數(shù)超過150萬人[1]。IBD包括克羅恩?。–rohn’s Disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC），發(fā)病原因多為持續(xù)性腸道感染、腸粘膜屏障缺陷、免疫失調(diào)，也與遺傳因素及環(huán)境因素有關(guān)[2?3]，UC是炎癥性腸病的主要亞型之一，臨床癥狀主要表現(xiàn)為：腹痛、腹瀉、體重減輕、黏液血便等[4]。

多糖是黃芪的主要活性成分之一，在黃芪的不同藥材基源中，尤以產(chǎn)于我國山西省北部至內(nèi)蒙古自治區(qū)中南部的正北芪多糖含量最高，療效最佳[5]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、抗病毒、保護心血管、降血糖等多種藥理功效[6?8]。研究表明，黃芪多糖或者黃芪多糖與其他藥物組成的復(fù)方對UC均有治療作用。錢江等[9]研究發(fā)現(xiàn)黃芪與麥冬復(fù)合多糖可抑制促炎因子和刺激抗炎因子的釋放，對結(jié)腸炎有一定的改善作用。Yang等[10]采用TNBS誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以通過調(diào)節(jié)TNF-α，IL-1β和NFATc4的表達，顯著改善實驗性大鼠結(jié)腸炎。但是黃芪多糖對UC的具體作用機制尚不明確，本研究用5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型[11?12]，分析APS對結(jié)腸炎小鼠的治療效果，從而探究其對UC小鼠的可能作用機制，為進一步深入研究結(jié)腸炎的治療方法提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠 5～6周齡SPF級雄性C57BL/6Cnc小鼠，體重（20±1.5）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006；正北芪多糖（96.82%） 產(chǎn)自山西恒廣北芪生物科技股份有限公司的正北芪，前期實驗采用超聲輔助-水提法提取并經(jīng)除雜分離純化后得到的純正北芪多糖；地塞米松（98%） 上海沃凱化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖硫酸鈉（DSS，M.W.=50000） 上海源葉生物科技有限公司；SOD、MPO、NOS、MDA、NO測定試劑盒 南京建成科技有限公司；IL-6、IL-1β、D-LA、DAO、TNF-α血清細胞因子測定試劑盒 上海江萊生物科技有限公司。

新世紀T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；XMTD-6000恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司；TD5A臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；G50電動組織研磨器南京沃拓儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與干預(yù) 將50只5～6周齡，體重20.0±1.5 g的C57BL/6Cnc清潔級雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為5組，即空白組、模型組（DSS組）、高濃度APS組、低濃度APS組、陽性對照組，小鼠的飼養(yǎng)、實驗和處死過程均遵照實驗動物管理條例和福利倫理指南執(zhí)行。根據(jù)文獻[10,13]資料及預(yù)實驗效果，除空白組外，其他組別自由飲用5%DSS水溶液連續(xù)7 d，建立小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，造模成功之后進行給藥治療一周，如表1。第14 d小鼠禁食16 h，但不禁水不禁藥，第15 d摘采集小鼠外周血，結(jié)腸標本備檢。

表1 試驗小鼠分組和給藥方案Table 1 Animal grouping and drug administration of experimental mice

1.2.2 指標檢測

1.2.2.1 小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）評分 實驗過程中，每天觀察記錄小鼠的精神、體重、糞便、活動、飲食、存活等情況，并根據(jù)表2進行DAI評分[14]。

表2 DAI評分標準Table 2 DAI scoring criteria

1.2.2.2 小鼠結(jié)腸長度及病理組織學(xué)觀察 取肛門至回盲部的結(jié)腸，觀察記錄炎癥及潰瘍情況，并測量長度；取部分結(jié)腸組織用10%福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)4μm病理切片（HE染色），顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜損傷情況。

1.2.2.3 小鼠血清中D-LA、DAO、IL-6、IL-1β、TNF-α含量測定 第15 d摘小鼠眼球取血置于1.5 mL離心管中，3000 r/min離心15 min后取血清于?80℃凍存?zhèn)溆谩Ｑ逯蠨-LA、DAO、IL-6、IL-1β、TNFα含量測定嚴格按照ELISA檢測試劑盒的說明操作進行。

1.2.2.4 小鼠結(jié)腸中MPO、SOD、NOS活性，以及MDA含量和NO水平檢測 取小鼠結(jié)腸組織稱重并剪碎，以冰生理鹽水作勻漿介質(zhì)，利用勻漿器冰上勻漿成10%勻漿液，根據(jù)試劑盒的要求對MPO、SOD、NOS活性，以及MDA含量和NO水平進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，用Excel作相關(guān)數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 正北芪多糖對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI的影響

與空白組小鼠相比，經(jīng)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠體重顯著降低，排便頻率增加，且糞便性狀松散或者含水，并粘有粘液和/或血液。由圖1可知，DSS組的DAI評分極顯著高于空白組（P<0.01），APS組、陽性對照組的DAI評分極顯著低于DSS組（P<0.01），所以APS可減輕DSS造成的潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，具有改善作用。

圖1 潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI評分Fig.1 Scoreof diseaseactivity index in micewith ulcerative colitis

2.2 正北芪多糖對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響

結(jié)腸長度是評價潰瘍性結(jié)腸炎的重要指標之一，本研究中空白組小鼠結(jié)腸長度最長（表3），與空白組相比，DSS組小鼠的結(jié)腸長度極顯著縮短（P<0.01）；與DSS組相比，高濃度APS組和陽性對照組小鼠的結(jié)腸均極顯著恢復(fù)（P<0.01），而低濃度APS組無顯著差異（P>0.05）。由此說明，高濃度正北芪多糖水溶液可顯著恢復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎導(dǎo)致的小鼠結(jié)腸縮短。

表3 各組小鼠結(jié)腸長度及分析Table 3 Colon length and analysis of each group of mice

2.3 正北芪多糖對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

HE染色小鼠結(jié)腸組織病理切片，光鏡下觀察，如圖2，空白組：結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體連續(xù)，結(jié)構(gòu)清晰，無炎癥和潰瘍，未見明顯病理改變。DSS組：結(jié)腸有大面積的潰瘍，黏膜水腫，上皮脫落，炎細胞浸潤明顯增多。高濃度APS組和陽性對照組：結(jié)腸恢復(fù)情況較好，潰瘍面積明顯縮小，組織水腫和充血顯著減輕，炎細胞浸潤明顯減少。低濃度APS組：結(jié)腸恢復(fù)效果不明顯。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織病理切片F(xiàn)ig.2 Pathological section of colon tissue of each group mice

2.4 正北芪多糖對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清中D-LA、DAO水平的影響

D-LA和DAO水平分別是間接反應(yīng)腸道黏膜通透性和上皮細胞是否完整的一項指標[15]，如圖3，DSS組小鼠血清中D-LA、DAO水平極顯著高于空白組（P<0.01），說明小鼠潰瘍性結(jié)腸炎造模成功。與DSS組相比，高濃度APS組和陽性對照組小鼠D-LA、DAO水平均顯著降低（P<0.05），低濃度APS組無顯著差異，藏凱宏等[16]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可劑量依賴性地降低潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠血清中D-LA和DAO水平，本研究中高濃度APS組治療效果明顯好于低濃度APS組，與前人研究一致，即APS能修復(fù)結(jié)腸炎大鼠腸道黏膜屏障及改善腸道上皮細胞的損傷。

圖3 各組小鼠血清中D-LA、DAO水平Fig.3 D-LA,DAOlevels in serum of each group mice

2.5 正北芪多糖對結(jié)腸炎小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α濃度和結(jié)腸組織中MPO的影響

當(dāng)炎癥性腸病發(fā)生時，結(jié)腸組織中出現(xiàn)大量的炎癥細胞浸潤[17]，促炎因子的表達升高，如IL-6、TNF-α和IL-1β會大量釋放[18]，還有炎癥因子的介質(zhì)MPO，它是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶[19]，可誘導(dǎo)中性粒細胞及巨噬細胞產(chǎn)生自身炎癥反應(yīng)，間接或直接促進炎癥因子的釋放，從而引起炎癥細胞向炎癥部位聚集，從而加重炎癥病情[20?21]。由圖4可以看出，DSS組小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α的濃度和MPO活力極顯著高于空白組（P<0.01），表明炎癥反應(yīng)已發(fā)生。經(jīng)APS和藥物干預(yù)后，高濃度APS組和陽性對照組的小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α的濃度和MPO活力顯著低于DSS組（P<0.05），低濃度APS組小鼠的小鼠血清中IL-1β、TNF-α的濃度無顯著差異，但IL-6極顯著降低（P<0.01）。并且上述病理切片顯示炎癥細胞浸潤明顯減少，腸道黏膜有一定程度的修復(fù)，由此說明高濃度APS可以降低細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的濃度和MPO活力，降低潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)，從而達到預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

圖4 各組小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α的濃度及MPO活力Fig.4 Concentrations of IL-6,IL-1β,TNF-α and MPO activity each group mice

2.6 正北芪多糖對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠SOD、NOS活力及MDA、NO水平的影響

炎癥性腸病發(fā)生時，NOS的表達增高，催化產(chǎn)生NO，導(dǎo)致NO含量增多[22]。體內(nèi)過量的NO可以誘導(dǎo)某些炎癥細胞因子如IL-8，TNF-α和IL-1β的釋放[17]，NO還可與SOD的底物超氧陰離子迅速結(jié)合，產(chǎn)生具有強氧化作用的過氧亞硝酸鹽，參與炎癥性腸病的發(fā)病機制[23]。由圖5可以看出，DSS組小鼠結(jié)腸組織中的NOS活性、MDA含量和NO水平6極顯著高于空白組（P<0.01），但SOD活性極顯著降低（P<0.01）；各個給藥組的小鼠結(jié)腸組織中的NOS活性及MDA含量和NO水平顯著低于DSS組（P<0.05），高濃度APS組和陽性對照組的SOD活性顯著升高（P<0.05），低濃度APS組的SOD無顯著差異，表明高濃度APS對潰瘍性結(jié)腸炎有所改善，顯著提高患病小鼠抗氧化能力，從而直接或間接地減輕UC的炎癥反應(yīng)。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織中SOD、NOS活力及MDA、NO水平Fig.5 Activity of SOD, NOS,MDA and NOin colon tissueof each group mice

3 討論與結(jié)論

近年來，炎癥性腸病的患病率逐漸上升，UC是較為常見的炎癥性腸病。臨床上治療以控制炎癥，抑制自身免疫反應(yīng)，改善腸道黏膜屏障功能等措施為主[24]。本研究中APS組和陽性對照組的DAI評分極顯著低于模型組（P<0.01），高濃度APS組有效恢復(fù)了UC小鼠結(jié)腸長度和修復(fù)結(jié)腸組織，且從組織學(xué)的結(jié)果來看，高濃度APS水溶液與1μg·mL?1地塞米松水溶液療效相當(dāng)，對UC小鼠具有一定的治療作用。

細胞因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中起重要作用，UC小鼠血清中的促炎細胞因子水平較高，如IL-6、IL-1β、TNF-α等[25]，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)高濃度APS治療后，IL-6、IL-1β、TNF-α含量明顯減少，由此推測APS對UC的治療作用可能是通過減少Th1細胞的細胞因子數(shù)來實現(xiàn)的。APS具有明顯抗氧化作用，其對UC的修復(fù)作用主要通過降低組織MDA水平，提高SOD水平實現(xiàn)[26]。本研究進一步考察了NOS活性和NO含量，APS能極顯著降低NOS活性和NO含量（P<0.01），即APS能顯著提高患病小鼠結(jié)腸組織中的抗氧化能力，還有可能是通過降低NOS活性和NO含量，進而阻止過氧亞硝酸鹽的形成和細胞因子的釋放，從而減輕UC的炎癥反應(yīng)，所以抑制NOS產(chǎn)生NO可能是治療UC的主要靶點之一[27]。

綜上所述，日常飲用0.7 mg·mL?1APS水溶液對UC小鼠具有顯著療效，其作用效果與抗氧化、改善腸道黏膜屏障功能、減少炎癥因子的釋放有關(guān)，但是APS對UC的作用機制具有多途徑、多靶點的特點[28]，后續(xù)有待進一步深入分析結(jié)腸組織內(nèi)的蛋白質(zhì)、mRNA以及其他臟器的指標，探究APS對UC的其明確的靶向作用機制。