半胱氨酸處理對(duì)采后金針菇品質(zhì)和抗氧化活性的影響

侯 權(quán)，竇立耿，錢霄晨，張之涵，姜天甲,

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州 310018；2.連云港市南云臺(tái)林場管理處，江蘇連云港 222062）

金針菇（Flammulina velutipes）是一種組織脆嫩、味道鮮美的真菌[1]，而其貯藏特點(diǎn)是需氧代謝旺盛，采后衰老迅速，容易出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。研究表明[2]當(dāng)金針菇遭受脅迫條件或處于衰老過程中，內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)含量不斷降低，活性氧在細(xì)胞各處的含量不斷增加，會(huì)造成內(nèi)部自由基代謝失調(diào)，從而惡性循環(huán)，造成不可逆的傷害，如細(xì)胞膜的完整性受損、物質(zhì)消耗過快、組織褐變、菌柄軟化、加速品質(zhì)衰老[3]。因此，低溫貯藏期間氧化還原狀態(tài)的調(diào)控對(duì)金針菇的貯藏保鮮起著不可忽視的作用[4]。目前應(yīng)用性研究中，低溫結(jié)合氣調(diào)保鮮[5]、低溫結(jié)合化學(xué)保鮮[6]以及低溫結(jié)合聚乙烯膜包裝[7]是采后金針菇常用的保鮮方法，但影響因素較為復(fù)雜、較難調(diào)控。近年國內(nèi)外研究都在探索其他綠色、高效的保鮮方法來提高金針菇內(nèi)部抗氧化能力。例如，較多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)3μmol/L油菜素內(nèi)酯[4]、250μmol/L水楊酸浸泡處理[8]和100μmol/L外源茉莉酸甲酯熏蒸處理[9]都能夠通過提高食用菇內(nèi)部抗氧化物質(zhì)的含量，保持食用菇較高的感官品質(zhì)。

半胱氨酸（cysteine，Cys）是一種公認(rèn)安全、無毒的天然抗褐變劑[10]，已廣泛應(yīng)用于不同的鮮切果蔬。果蔬中酶的活性對(duì)于p H和抗褐變物質(zhì)有高度敏感性，如半胱氨酸、植酸等，并且這些褐變抑制劑結(jié)合冷庫貯藏的應(yīng)用還能有效抑制衰老過程中的組織代謝紊亂，并保持產(chǎn)品較好的感官和生化品質(zhì)[11]。例如配制抗褐變?nèi)芤簳r(shí)添加2%的半胱氨酸，浸泡鮮切蘋果片30 s，可以抑制其品質(zhì)惡化[12]；1%的半胱氨酸溶液能夠抑制鮮切馬鈴薯[13]和萵苣[14]的酶促褐變，保持較好的外觀品質(zhì)。所以適當(dāng)濃度的半胱氨酸處理能夠減少果蔬切割面以及內(nèi)部的褐變和物質(zhì)流失，并且有抑菌、維持果蔬營養(yǎng)和風(fēng)味的效果[15?16]。然而，目前鮮有研究報(bào)道半胱氨酸處理對(duì)采后金針菇品質(zhì)和抗氧化水平的影響。為此，本實(shí)驗(yàn)以15 mmol/L半胱氨酸處理采后新鮮金針菇，研究在2～3℃貯藏12 d中金針菇的品質(zhì)和內(nèi)部抗氧化能力的變化，并且對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，為半胱氨酸在食用菌低溫貯藏的研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白色金針菇 自山東省鄒城市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園挑選新鮮、無表觀損傷的金針菇；L-半胱氨酸（純度>99%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；多酚氧化酶測(cè)定試劑盒、過氧化物酶測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

3-30K高速離心機(jī) 德國SIGMA公司；UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；DDSJ-308A電導(dǎo)率儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；WYA-2S阿貝折射儀 上海彼愛姆光學(xué)儀器有限公司；Infinite F50酶標(biāo)儀 瑞士TECAN 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 處理方法 通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，15 mmol/L半胱氨酸浸泡20 min的感官品質(zhì)最佳。因此，將挑選好的金針菇隨機(jī)分成兩組，分別為15 mmol/L半胱氨酸的處理組和對(duì)照組。用對(duì)應(yīng)溶液將金針菇完全浸沒，20 min后取出，在20～25℃的陰涼處風(fēng)干。2 h之后進(jìn)行裝筐，每3株一筐，并套上0.5 mm厚度的PE袋。在恒定條件（溫度2～3℃、空氣濕度90%～95%）的環(huán)境中存放12 d，定期進(jìn)行查看、取樣和測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。保存新鮮樣品時(shí)，需將金針菇快速切塊，用液氮速凍，存放于?80℃的冰箱。后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前，稱取適量塊狀樣品，在液氮中研磨成粉，隨即進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1 呼吸強(qiáng)度、失重率、褐變度的測(cè)定 呼吸強(qiáng)度測(cè)定參考?jí)A液吸收法[17]，單位為mg/（kg·h）。

失重率測(cè)定參考Wang等[18]的方法，并略作修改。每組固定6株金針菇測(cè)定失重率，其計(jì)算見公式（1）。

褐變度的測(cè)定參考郎艷[19]的方法，并根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)稍有改動(dòng)。稱取3 g樣品，再加入5 mL磷酸鈉緩沖液（pH=6.5，0.2 mol/L），放置10 min后離心（4℃、10000×g、15 min），最后取上清液在450 nm處測(cè)定，并表示為OD450×2。

1.2.2.2 可溶性固形物、可溶性蛋白含量的測(cè)定 可溶性固形物測(cè)定：金針菇研磨、過濾，將獲取的汁液覆蓋阿貝折射儀測(cè)定窗口，記錄數(shù)值（%）。

可溶性蛋白測(cè)定：在5 mL的蒸餾水，混入2 g樣品，離心（4℃、12000×g、20 min）。將上清液稀釋10倍后再進(jìn)行測(cè)定，參考考馬斯亮藍(lán)染色法[17]，并略作改動(dòng)。

1.2.2.3 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定 參考姚亞明等[1]的方法，并略作修改。稱取5 g新鮮金針菇組織置于內(nèi)壁干燥的比色管中，再加入30 mL超純水，在靜置浸泡1 h，測(cè)定電導(dǎo)率，用錫箔紙包裹錐形瓶瓶口，在沸水中沸騰30 min，快速冷卻后測(cè)定電導(dǎo)率，相對(duì)電導(dǎo)率的計(jì)算見公式（2）。

式中：P1為靜置1 h后的電導(dǎo)率，μS/cm；P2為煮沸冷卻后的電導(dǎo)率，μS/cm。

1.2.2.4 多酚氧化酶和過氧化物酶活性的測(cè)定 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性測(cè)定參考試劑盒的操作步驟。在1 mL酶提取液加入0.4 g樣品，在低溫下離心（4℃、10000×g、10 min），獲得粗酶提取液。各150μL的粗酶提取液和煮沸的酶液分別與緩沖液和基質(zhì)液組成反應(yīng)體系，之后進(jìn)行孵育、離心、測(cè)定吸光值。以鮮質(zhì)量計(jì)，單位為U/g。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活性測(cè)定參考試劑盒的操作步驟。在3 mL的磷酸緩沖液（pH=7.0，0.1 mol/L）中加入2 g樣品，離心（4℃、10000×g、10 min），獲得酶提取液并加入到應(yīng)用液中，最后于420 nm下測(cè)定吸光值。以鮮質(zhì)量計(jì)，單位為U/g。

1.2.2.5 總酚含量、抗壞血酸含量的測(cè)定 總酚含量的測(cè)定參考福林酚法[20]。樣品測(cè)定：取6 mL提前預(yù)冷的60%乙醇，加入1 g樣品，兩者在渦旋儀上混勻，低溫離心（4℃、10000×g、30 min）。取3.0 mL福林酚，加入0.7 mL上清液，暗處放置1 min，再加入2 mL的碳酸鈉溶液（20 g/mL），最后于40℃的水浴鍋中保溫2 h，取出冷卻，測(cè)定混合溶液吸光度。以鮮質(zhì)量計(jì)，單位為mg/100g。

抗壞血酸含量的測(cè)定參考劉萍等[21]的方法，以鮮質(zhì)量計(jì)，單位為mg/100 g。

1.2.2.6 抗氧化酶活性和自由基清除率的測(cè)定 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性按照SOD試劑盒里的羥胺法測(cè)定。

谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性按照GR試劑盒里紫外比色法進(jìn)行測(cè)定。以上單位都為U/g，以鮮質(zhì)量計(jì)。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率測(cè)定方法[22]如下。將無水乙醇提前進(jìn)行預(yù)冷，取5 mL加入2 g樣品，低溫離心（4℃、10000×g、20 min）獲得提取液，取0.3 mL，加入9.0 mL蒸餾水，渦旋混勻用于DPPH清除活性的測(cè)定。測(cè)定方法：配制好0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，吸取2 mL并與同體積樣品稀釋液進(jìn)行混合，在20～25℃的環(huán)境中放置30 min后測(cè)定。相關(guān)計(jì)算見公式（3）

式中：A0表示對(duì)照組在517 nm處的吸光值；A1表示樣品在517 nm吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。采用Excel 2010對(duì)所有原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和計(jì)算；同時(shí)結(jié)合SPSS18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析；所有圖片的繪制都采用Origin 2018軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 半胱氨酸處理對(duì)金針菇呼吸強(qiáng)度、失重率、褐變度的影響

金針菇在貯藏期間仍在呼吸代謝。如圖1A所示，在前6 d內(nèi)，兩組處理的樣品的呼吸強(qiáng)度變化都較為平緩，6 d之后呼吸強(qiáng)度持續(xù)升高。說明在低溫貯藏的開始階段，金針菇的呼吸代謝受到抑制，后期呼吸強(qiáng)度升高，原因可能是內(nèi)部代謝逐漸紊亂，而半胱氨酸處理組的呼吸強(qiáng)度上升速率較對(duì)照組顯著減緩（P<0.05）。貯藏結(jié)束時(shí)，對(duì)照組的呼吸強(qiáng)度顯著高于半胱氨酸處理組（20.10%）。Fang等[23]研究發(fā)現(xiàn)降低呼吸強(qiáng)度是延緩金針菇采后生長和衰老的一種有效的途徑。由此可見，在貯藏的后期，半胱氨酸處理能夠通過抑制新鮮金針菇的呼吸強(qiáng)度，從而進(jìn)一步減緩代謝速率，延緩品質(zhì)劣變。

如圖1B所示，在整個(gè)貯藏期間，金針菇的失重率持續(xù)升高，兩組之間沒有顯著差異（P>0.05）。說明施加外源半胱氨酸對(duì)失重率沒有顯著影響。研究表明，當(dāng)果蔬失重率達(dá)到5%～6%之間時(shí)，可認(rèn)為已經(jīng)開始喪失商品價(jià)值[24]。在本研究中的貯藏末期，對(duì)照組和半胱氨酸組的失重率分別為4.29%、4.22%，均低于5%，說明12 d后兩組樣品仍有一定的商品價(jià)值。

褐變是造成蘑菇質(zhì)量損失和產(chǎn)品商業(yè)價(jià)值降低的主要原因[25]。圖1C為不同處理組中褐變度的變化，褐變度在前9 d都呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，而對(duì)照組在第9 d的褐變度最高。在第3、6、9 d，對(duì)照組的褐變度顯著高于處理組（P<0.05），褐變度分別是處理組的1.29、1.28、1.15倍。由此說明半胱氨酸對(duì)于金針菇顏色變化的控制效果較為顯著。

圖1 半胱氨酸處理對(duì)貯藏期金針菇呼吸強(qiáng)度、失重率和褐變度的影響Fig.1 Effects of cysteine treatment on respiration intensity ,weight loss rate and Browning degree of Flammulina velutipes during storage

2.2 半胱氨酸處理對(duì)金針菇可溶性固形物、可溶性蛋白含量的影響

可溶性固形物在沒有從外界吸收補(bǔ)充的狀態(tài)下，其含量的降低和貨架期呈正比[26]。圖2A表示，第3 d之后，兩組處理可溶性固形物含量都逐漸下降，然而半胱氨酸處理的可溶性固形物下降速率較為緩慢，第6 d和第9 d時(shí)，其可溶性固形物的含量分別是對(duì)照組的1.10、1.12倍。由此說明，對(duì)金針菇進(jìn)行半胱氨酸浸泡處理，可以減輕可溶性固形物的消耗。

可溶性蛋白是食用菌含有的重要的營養(yǎng)物質(zhì)，采后其含量會(huì)因?yàn)楹粑x逐漸下降，也有調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的作用。如圖2B所示，兩組可溶性蛋白的含量持續(xù)下降，然而半胱氨酸顯著抑制可溶性蛋白水解（P<0.05）。在貯藏的第3、6、9 d，半胱氨酸處理組的可溶性蛋白質(zhì)含量分別是對(duì)照組的1.31、1.21、1.33倍。由此說明，半胱氨酸處理抑制了金針菇中可溶性蛋白下降，從而維持細(xì)胞膜滲透壓。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)長根菇水溶性多糖對(duì)平菇進(jìn)行浸泡處理，處理組的相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性蛋白的水解速率顯著降低，保持了平菇較高的感官品質(zhì)。

圖2 半胱氨酸處理對(duì)貯藏期金針菇可溶性固形物和可溶性蛋白的含量影響Fig.2 Effects of cysteine treatment on soluble solids and soluble protein content of Flammulina velutipes during storage

2.3 半胱氨酸處理對(duì)金針菇相對(duì)電導(dǎo)率的影響

完整的細(xì)胞膜系統(tǒng)是生物體正常生理活動(dòng)的基本保證。膜的完整性體現(xiàn)在膜的透氣性上，而透氣性可以通過電解質(zhì)泄漏的變化來衡量[28]。如圖3所示，對(duì)照組金針菇的相對(duì)電導(dǎo)率從第0 d開始一直在升高。半胱氨酸組于第6 d開始升高。貯藏的第6和9 d，處理組的相對(duì)電導(dǎo)率較對(duì)照組降低22.53%和15.24%。由此說明，在貯藏期間半胱氨酸處理能降低物質(zhì)代謝速率，維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓穩(wěn)定，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)。

圖3 半胱氨酸處理對(duì)貯藏期金針菇相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effects of cysteine treatment on relative electrolytic leakage of Flammulina velutipes during storage

2.4 半胱氨酸處理對(duì)金針菇多酚氧化酶和過氧化物酶活性的影響

引起組織褐變常見的原因有果蔬內(nèi)部相關(guān)酶活性及含量異常升高，如POD和PPO等[29?30]。如圖4A、圖4B，PPO和POD活性都是不斷升高的。相比對(duì)照組，半胱氨酸組顯著控制了兩種酶活性的上升（P<0.05）。在貯藏的最后一天，相比對(duì)照組，半胱氨酸處理組的PPO活性降低了13.78%，并且伴隨著POD活性降低了26.49%。推測(cè)半胱氨酸處理能夠通過調(diào)控PPO和POD活性，進(jìn)一步維持金針菇較好的感官品質(zhì)。并且本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果與靳禎亮[31]得出的結(jié)論相符合，即麥角硫因處理可以有效降低PPO活性，對(duì)食用菇有較好的護(hù)色效果。

圖4 半胱氨酸處理對(duì)貯藏期金針菇PPO和POD活性的影響Fig.4 Effectsof cysteinetreatment on activitiesof PPO and PODof Flammulina velutipes during storage

2.5 半胱氨酸處理對(duì)金針菇總酚和抗壞血酸含量的影響

金針菇中自身含有一些保護(hù)細(xì)胞內(nèi)重要分子免受氧化的自由基清除劑，常見有總酚、抗壞血酸等[32]，因此需要減少這些抗氧化物質(zhì)的過度消耗。圖5A顯示，對(duì)照組的總酚在貯藏的前9 d變化并不明顯，在貯藏的第9 d其含量略低。而半胱氨酸組總酚含量在第6 d最高，并且保持較穩(wěn)定的水平。在貯藏結(jié)束時(shí)，半胱氨酸處理金針菇的總酚含量要比對(duì)照組高12.31%。圖5B顯示，抗壞血酸始終在消耗，而半胱氨酸處理的金針菇的抗壞血酸降低速度始終低于對(duì)照組。在貯藏最后一天，半胱氨酸組與對(duì)照組的抗壞血酸含量分別達(dá)到21.66和15.85 mg/100 g。由此發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸處理的金針菇總酚和抗壞血酸的含量都維持較高的水平。

圖5 半胱氨酸處理對(duì)貯藏期金針菇總酚含量、抗壞血酸含量活性的影響Fig.5 Effects of cysteine treatment on Total phenol content,ascorbic acid of Flammulina velutipes during storage

2.6 半胱氨酸處理對(duì)金針菇抗氧化酶活性和自由基清除率的影響

與組織抗氧化能力有關(guān)的指標(biāo)還有SOD、GR、DPPH清除活性等。吳媛媛等[33]探討受灰霉菌侵染的藍(lán)莓果實(shí)體在貯藏期間自由基和抗氧化物質(zhì)含量的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)在貯藏前期，自由基含量、SOD和GR的活性同時(shí)上升，果實(shí)外觀并無明顯變化；在貯藏后期，抗氧化物質(zhì)含量下降，由于無法及時(shí)處理過量的自由基，組織開始軟化、腐爛。在本實(shí)驗(yàn)中，金針菇的SOD活性如圖6A顯示從貨架期第6 d開始下降，在貯藏的最后一天，兩組的SOD活性都最低，但半胱氨酸處理的金針菇所含SOD活性顯著高于另外一組（P<0.05），是另外一組的1.48倍。如圖6B所示，對(duì)照組的GR活性從第3 d開始下降。而半胱氨酸組的GR活性在前6 d都是增加的，第6 d時(shí)，其GR的活性是對(duì)照組的1.56倍（P<0.05）。由此可見，半胱氨酸處理組可以維持較高的SOD和GR活性。

由圖6C顯示，對(duì)照組的DPPH自由基清除活性始終處于較低的水平。第3 d以后，半胱氨酸組的樣品始終保持較高的清除活性，在貯藏的第12 d，半胱氨酸組的DPPH自由基清除率是對(duì)照組的1.33倍。因此，半胱氨酸處理能使金針菇組織內(nèi)維持較高的DPPH自由基清除率。這個(gè)結(jié)果與Wu等[25]的結(jié)果相似，即短波紫外照射增強(qiáng)了貯藏期間蘑菇內(nèi)蓋、莖柄和整個(gè)菌體的抗氧化活性，其中莖柄中DPPH自由基清除活性最高。半胱氨酸維持較高DPPH自由基清除活性可能與其組織中較高的總酚和抗壞血酸等抗氧化物質(zhì)含量有關(guān)[34]。

圖6 半胱氨酸處理對(duì)貯藏期金針菇SOD活性、GR活性和DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of cysteine treatment on activities of SOD,GR and DPPH free radical scavenging rate of Flammulina velutipes during storage

2.7 主要指標(biāo)相關(guān)性分析

通過表1可知半胱氨酸組的呼吸強(qiáng)度與褐變度、可溶性固形物、DPPH自由基清除率的相關(guān)系數(shù)分別是0.909、?0.932、?0.903，呈顯著或極顯著相關(guān)（P<0.05或P<0.01），而處理組呼吸強(qiáng)度與褐變度、可溶性固形物、DPPH自由基清除率之間并沒有顯著相關(guān)（P>0.05），表明半胱氨酸組的呼吸代謝與內(nèi)部物質(zhì)含量以及品質(zhì)變化的關(guān)系密切相關(guān)。并且相比于對(duì)照組，半胱氨酸組的褐變度和PPO活性、POD活性、可溶性固形物、SOD活性、抗壞血酸含量相關(guān)系數(shù)分別為0.967、0.898、?0.894、?0.924、?0.912，均呈顯著或極顯著相關(guān)（P<0.05或P<0.01），表明半胱氨酸組金針菇的色澤變化依賴于酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的高低，并且說明褐變度的抑制程度可以作為評(píng)價(jià)半胱氨酸處理效果的重要指標(biāo)。

表1 Pearson’s相關(guān)系數(shù)Table 1 Pearson’scorrelation coefficients

3 結(jié) 論

本文研究了半胱氨酸處理對(duì)低溫貯藏條件（2～3℃）下新鮮金針菇品質(zhì)指標(biāo)以及理化指標(biāo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)15 mmol/L的半胱氨酸處理通過延緩代謝速率和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的分解，從而保持膜內(nèi)外滲透壓的穩(wěn)定性。與此同時(shí)，半胱氨酸能夠顯著降低金針菇組織內(nèi)酶促褐變機(jī)率，從而有效延緩組織褐變。并且處理組與對(duì)照組相比，能保持較高內(nèi)源性抗氧化劑含量，提高SOD、GR活性和DPPH清除活性。由此說明，15 mmol/L的半胱氨酸處理能夠維持新鮮金針菇內(nèi)部氧化體系的穩(wěn)定性，從而延緩低溫條件下金針菇的衰老和品質(zhì)變化。

本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，處理組的品質(zhì)指標(biāo)（呼吸強(qiáng)度、褐變度）與內(nèi)源的抗氧化指標(biāo)（抗壞血酸、SOD等）呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），也間接的驗(yàn)證新鮮金針菇采后感官品質(zhì)與抗氧化物質(zhì)變化密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)從品質(zhì)指標(biāo)、褐變相關(guān)酶活力以及抗氧化能力等多方面探討了半胱氨酸在食用菌低溫貯藏中應(yīng)用的科學(xué)性，但本實(shí)驗(yàn)也存在不足：在冷藏條件下，單純的半胱氨酸浸泡處理對(duì)于保存新鮮食用菇是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，之后將會(huì)進(jìn)一步探索如何將半胱氨酸以適當(dāng)?shù)谋壤砑釉诳墒秤猛磕ぶ?，結(jié)合冷庫氣調(diào)貯藏，盡可能降低食用菇物質(zhì)損耗，延長其鮮食壽命。